研究目的：肺癌是當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的惡性腫瘤,發(fā)病率在多數(shù)國(guó)家呈明顯增高趨勢(shì),其中非小細(xì)胞肺癌大約占所有肺癌的75%～85%,5年平均生存率小于15%,多數(shù)患者死于放療和化療所帶來(lái)的不良反應(yīng)。因此,從天然化合物中尋找安全、有效的、低毒的抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物的重要發(fā)展戰(zhàn)略之一。沙蟾毒精是蟾酥中的主要活性成分之一,是C-17位含有一個(gè)吡喃酮環(huán)的C-24甾體類(lèi)化合物,分子式為C24H32O6,分子量為416.511,具有廣譜的抗腫瘤作用。近期研究表明,沙蟾毒精能抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。然而,包括沙蟾毒精在內(nèi)的C-24甾體類(lèi)化合物一般都含有較窄的治療窗和較高的毒性。藥物動(dòng)力學(xué)是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律(ADME)的一門(mén)學(xué)科。藥物在作用部位的濃度與藥理作用的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間直接相關(guān)。藥物經(jīng)過(guò)生物轉(zhuǎn)化后,其相應(yīng)的理化性質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化,從而引起藥理及毒理活性的改變,通常代謝過(guò)程中藥物極性增加,有利于生物體的排泄。了解藥物在體內(nèi)ADME過(guò)程,有利于進(jìn)一步解析其藥理與毒理作用。因此,本課題研究目的是探討沙蟾毒精和其代謝產(chǎn)物1p-羥基-沙蟾毒精誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用及其藥代動(dòng)力學(xué)研究。研究?jī)?nèi)容分為三部分：第一部分是沙蟾毒精誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡的研究。第二部分是沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化及其產(chǎn)物1β-羥基-沙蟾毒精對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡的研究。對(duì)大鼠體內(nèi)沙蟾毒精的代謝物進(jìn)行初步篩查,根據(jù)代謝物特征推測(cè)沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的代謝途徑。探討1β-羥基-沙蟾毒精誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制以及其抑制PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。第三部分是沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和組織分布研究。建立測(cè)定大鼠血漿及組織樣品中沙蟾毒精和代謝物1 β-羥基-沙蟾毒精濃度的定量分析方法,對(duì)其的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布進(jìn)行初步研究,闡明沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程和組織分布規(guī)律。研究方法：(1)MTT法測(cè)定沙蟾毒精對(duì)A549細(xì)胞抑制率,測(cè)定IC50值。采用倒置顯微鏡、Hochest33342染色實(shí)驗(yàn)觀察沙蟾毒精處理A549細(xì)胞后所發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變,檢測(cè)“凋亡小體”；采用AnnexinV/PI雙染色流式細(xì)胞法觀測(cè)細(xì)胞凋亡比例。PI單染流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期的變化。(2)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大鼠尿液,膽汁和糞便中沙蟾毒精的濃度,研究沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的排泄動(dòng)力動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。同時(shí)運(yùn)用LC-MS分析技術(shù)和Lightsight計(jì)算機(jī)軟件處理數(shù)據(jù),初步推測(cè)沙蟾毒精在大鼠膽汁、尿液、糞便和血漿的代謝產(chǎn)物及其代謝通路。MTT法測(cè)定1β-羥基-沙蟾毒精對(duì)A549細(xì)胞抑制率,測(cè)定ICso值。采用倒置顯微鏡、Hochest33342觀察1β-羥基-沙蟾毒精處理A549細(xì)胞后所發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變；采用AnnexinV/PI雙染色流式細(xì)胞法觀測(cè)細(xì)胞凋亡。PI單染流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期的變化。PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)了A549細(xì)胞PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路、Bax、Bcl-2、 Caspase-3和Caspase-9基因和蛋白的變化。劃痕試驗(yàn)和Transwell小室試驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移和侵襲。(3)超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大鼠血漿及組織中沙蟾毒精和1p-羥基-沙蟾毒精的濃度,研究沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)過(guò)程及組織分布特點(diǎn),獲得主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、t1/2、MRT0-t、AUC0-t、AUC0-∞,闡明沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精組織分布規(guī)律。研究結(jié)果：(1)沙蟾毒精能夠抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng),A549細(xì)胞經(jīng)過(guò)沙蟾毒精處理后,細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯受抑制,增殖速度明顯減弱,細(xì)胞相互分散,A549細(xì)胞出現(xiàn)了突起短縮,細(xì)胞逐漸由梭狀變成橢圓形或圓形,體積變小、胞質(zhì)皺縮減少,固縮且深染,折光性變差。細(xì)胞中可以見(jiàn)到很多空泡狀改變現(xiàn)象,部分細(xì)胞脫離貼壁生長(zhǎng)狀態(tài),成為懸浮細(xì)胞。且呈現(xiàn)劑量依賴性,其IC50值為431nM。Hoechst33342熒光染色實(shí)驗(yàn)可看到邊集的細(xì)胞不斷增加,細(xì)胞核高度固縮、凝聚,出現(xiàn)“凋亡小體”。G2/M期細(xì)胞百分率顯著增加(F=71.54,P0.001),G1期細(xì)胞百分率顯著降低(F=25.99,P0.001)。隨著沙蟾毒精濃度的增加,G2/M期細(xì)胞所占比例明顯增加,并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AnnexinV-PI雙染結(jié)果顯示沙蟾毒精可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡,且隨著沙蟾毒精濃度的增加A549細(xì)胞的凋亡率也相應(yīng)的增加(F=111.1,P0.001)。(2)①測(cè)定膽汁、尿液和糞便中的沙蟾毒精的線性范圍為5.280-1056ng/mL(膽汁或尿液)和10.56-1056 ng/g(糞便),定量下限分別為5.280 ng/mL(膽汁或尿液)和10.56 ng/g(糞便)。膽汁、尿液和糞便日內(nèi)精密度分別為4.8%～9.5%、7.1%～9.3%和7.1%～11.0%,日間精密度分別為5.7%～10.0%、3.9%～12.2%和5.1%～10.6%,準(zhǔn)確度分別為-2.0%～1.6%、-2.1%～1.6%和-0.6%～4.3%。SD大鼠給藥4.0mg/kg后,原形藥物經(jīng)膽汁、尿液和糞便途徑24h累積排泄量占總給藥量的百分比分別為：2.301%、19.67%和1.726%,三者的總排泄率為23.70%;三者的t1/2分別為1.66±0.07 h、2.54±0.78 h和5.8±1.22 h。在大鼠體內(nèi)鑒定出沙蟾毒精的24種代謝物。其中膽汁中鑒定了17個(gè)代謝物,尿液中發(fā)現(xiàn)了16個(gè)代謝物,糞便中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)代謝物,血漿中發(fā)現(xiàn)18個(gè)代謝物,包括I相代謝產(chǎn)物和Ⅱ相代謝產(chǎn)物,所涉及的代謝反應(yīng)有：異構(gòu)化、氧化、還原、甲基化、與硫酸結(jié)合、與葡萄糖醛酸結(jié)合。②A549細(xì)胞經(jīng)用不同濃度1β-羥基-沙蟾毒精處理后,細(xì)胞生長(zhǎng)受到了明顯抑制,增殖速度明顯減弱,細(xì)胞間相互分散,細(xì)胞逐漸由梭狀變成橢圓形或圓形,體積變小、固縮且深染,折光性差。細(xì)胞透明度下降,細(xì)胞中出現(xiàn)了很多空泡狀改變現(xiàn)象,部分細(xì)胞脫離貼壁生長(zhǎng)狀態(tài),成為懸浮細(xì)胞。且呈劑量依賴性,其IC50值為208nM。Hoechst 33342染色實(shí)驗(yàn)可看到邊集細(xì)胞不斷增加,細(xì)胞核高度固縮、凝聚,出現(xiàn)了“凋亡小體”。PI單染結(jié)果顯示,G2/M期細(xì)胞百分比顯著增加(F=46.87,P0.001),G1期細(xì)胞百分比顯著降低(F=26.76,P0.001)。隨著1β-羥基-沙蟾毒精濃度的增加,G2/M期細(xì)胞所占比例明顯增加,并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AnnexinV-PI雙染結(jié)果顯示1β-羥基-沙蟾毒精可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡,且隨著1 β-羥基-沙蟾毒精濃度的增加A549細(xì)胞的凋亡率也相應(yīng)的增加(F=40.93,P0.001)。Western Blot和PCR結(jié)果均表明,1β-羥基-沙蟾毒精可下調(diào)PI3K/Akt/m-TOR和Bcl-2的蛋白表達(dá)和mRNA水平；而上調(diào)Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平,由此來(lái)增加Bax/Bcl-2比值。劃痕試驗(yàn)和Transwell小室試驗(yàn)表明,1β-羥基-沙蟾毒精能夠顯著降低549細(xì)胞的遷移率(F=78.86,P0.001)和侵襲率(F=57.13,P0.001),隨著濃度的增大抑制作用增強(qiáng)。(3)健康SD大鼠腹腔注射給予低、中、高三個(gè)劑量沙蟾毒精后,血漿中沙蟾毒精的Tm。x分別為12.5±2.7 mmin、11.7±2.6 min和11.7±2.6min; Cmax分別為1078±182.6 ng/mL、1981±566.5 ng/mL和4373±1354 ng/mL；t1/2分別為103.8±40.43 min、113.0±47.02 min和110.3±21.17min; MRT0-t分別為：45.6+6.8min、38.6±9.6 min和42.7±10.5 min；用梯形法計(jì)算,AUC0-t分別為39.56±11.10mg·min/L、79.67±26.06 mg-min/L和166.7±57.96 mg·min/L; AUC0-∞分別為39.63±11.14 mg·min/L、79.78±26.11 mg·min/L和166.9±57.80 mg·min/L。血漿中的1β-羥基-沙蟾毒精Tmax分別為59.28±7.319min,47.5±6.124min, 47.50±6.124min; Cmax分.別為125.48±15.31 ng/mL,206.3±79.88 ng/mL, 390.1±111.3 ng/mL; t1/2分別為113.8±37.48 min,106.3±39.42 min,123.8±47.43 min; MRT0-t分別為98.21±22.34 min,85.75±18.29 min,95.88±11.94min;用梯形法計(jì)算,AUCO-t分別為7.192±2.142 mg-min/L,13.43±3.945 mg-min/L, 26.47±8.460 mg-min/L, AUC0-∞分別為7.271±2.187 mg-min/L,13.46±3.958 mg-min/L,26.67±8.542 mg-min/L。沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精的Cmax和AUC與給藥劑量呈良好的相關(guān)性(P0.05)。健康SD大鼠單劑量腹腔注射給藥沙蟾毒精4.0 mg/kg后,沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精在心、肝、脾、肺、腎和腦等組織均有分布,沙蟾毒精在5.0 min或15 mmin時(shí)達(dá)到峰值,而1β-羥基-沙蟾毒精在45 min或60 min。給藥15 min后,沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精主要分布于腎臟、肝臟和肺,表明腎臟和肝臟是其排泄和代謝的主要器官,同時(shí)腎臟、肝臟和肺臟也是其作用的靶器官。給藥45 min后能在腦和睪丸中檢出沙蟾毒精和1p-羥基-沙蟾毒精的含量,表明該藥物能透過(guò)血腦和血睪屏障。結(jié)論：沙蟾毒精能抑制肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,阻滯細(xì)胞周期于G2/M期,呈劑量依賴性。排泄動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明沙蟾毒精其原型主要通過(guò)尿液途徑排泄,隨尿液、膽汁和糞便途徑24 h累積排泄量占總給藥量為23.43%。體內(nèi)代謝研究表明,沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的代謝主要是通過(guò)I相代謝的氧化反應(yīng)和Ⅱ相代謝的與硫酸或葡萄糖醛酸結(jié)合的反應(yīng)來(lái)完成,產(chǎn)生包括1β-羥基-沙蟾毒精在內(nèi)的24種代謝產(chǎn)物。1β-羥基-沙蟾毒精能抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。1β-羥基-沙蟾毒精能誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡,阻滯A549細(xì)胞周期于G2/M期。其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制可能為：①抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路,降低通路中相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯；②增加A549細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2比值,促進(jìn)凋亡因子Caspase-3和Caspase-9的轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡,產(chǎn)生一定的抗肺癌作用。通過(guò)藥物動(dòng)力學(xué)研究,獲得沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、MRT0-t、AUC0-t和AUC0-∞等。Cmax和AUC0-∞與給藥劑量呈良好的線性相關(guān)。沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精能迅速并廣泛的分布于各個(gè)組織,肝臟、腎臟和肺是主要分布器官,且沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精能透過(guò)血腦屏障和血睪屏障。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：R734.2;R96
【部分圖文】：

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本文編號(hào)：2860677