發(fā)布時(shí)間：2020-10-28 17:26

　　 背景:人類甲狀腺未分化癌(Anaplastic thyroid carcinoma,ATC)進(jìn)展快,死亡率高,治療效果較差,其對常用化療藥物阿霉素(Doxorubicin,DOX)耐藥一直是臨床難題。我們前期研究發(fā)現(xiàn),用阿霉素處理ATC細(xì)胞株后,存活少量的腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cell,CSCs)是ATC細(xì)胞發(fā)生耐藥的重要因素。因此,尋找合適的抗甲狀腺腫瘤及腫瘤干細(xì)胞的藥物是目前研究的熱點(diǎn)。近年研究證實(shí),穿心蓮內(nèi)酯類化合物對肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等有明顯的抗腫瘤作用,且具有抗多發(fā)性骨髓瘤腫瘤干細(xì)胞的效應(yīng)。然而,穿心蓮內(nèi)酯對ATC的作用暫無相關(guān)報(bào)道。納米技術(shù)的發(fā)展為腫瘤的診斷和治療提供了新的方法,我們前期研究也同時(shí)發(fā)現(xiàn),多巴胺黑色素納米粒子(Dopamine-melanin nanoparticles,DMNPs)與DOX結(jié)合,可以提高ATC耐藥株HTh74Rdox細(xì)胞對DOX的攝取能力,改善耐藥性。而DMNPs對穿心蓮內(nèi)酯的負(fù)載能力及結(jié)合后對HTh74Rdox耐藥性的改善作用尚不清楚,值得探索。目的:(1)評估穿心蓮內(nèi)酯在抑制甲狀腺未分化癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷徙等方面的效果。(2)探討穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合阿霉素化療增敏方面的價(jià)值及可能的作用機(jī)制。(3)觀察穿心蓮內(nèi)酯對甲狀腺腫瘤干細(xì)胞的作用及機(jī)制。(4)研究DMNPs對穿心蓮內(nèi)酯的裝載效率,觀察聯(lián)合穿心蓮內(nèi)酯和DMNPs對甲狀腺未分化癌細(xì)胞的作用。方法:(1)通過MTT和實(shí)時(shí)細(xì)胞分析觀察穿心蓮內(nèi)酯對甲狀腺未分化癌細(xì)胞株HTh74和阿霉素耐藥細(xì)胞株HTh74Rdox活性的抑制作用,及穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合阿霉素對HTh74Rdox活性的抑制作用。(2)通過細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測穿心蓮內(nèi)酯對HTh74Rdox細(xì)胞增殖的影響。(3)通過Caspase-3活性檢測、流式細(xì)胞技術(shù)評價(jià)穿心蓮內(nèi)酯對HTh74Rdox細(xì)胞凋亡的影響。(4)通過細(xì)胞劃痕試驗(yàn)觀察穿心蓮內(nèi)酯對HTh74Rdox細(xì)胞遷徙能力的影響。(5)通過小管形成試驗(yàn)評估穿心蓮內(nèi)酯對腫瘤血管形成的影響。(6)通過qPCR和Western Blot觀察不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細(xì)胞中多藥耐藥通道蛋白MDR1及ABCG2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。(7)通過qPCR和Western Blot檢測不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Oct-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平。(8)通過Western Blot檢測不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細(xì)胞中MAPK/ERK信號通路中ERK和p-ERK蛋白的表達(dá)水平。(9)通過紫外可見分光光度計(jì)測定多巴胺黑色素納米粒子對穿心蓮內(nèi)酯的裝載效率。(10)通過MTT檢測聯(lián)合穿心蓮內(nèi)酯和DMNPs對HTh74和HTh74Rdox細(xì)胞的活力。結(jié)果:(1)穿心蓮內(nèi)酯對甲狀腺未分化癌HTh74細(xì)胞和阿霉素耐藥株HTh74Rdox細(xì)胞的活性有抑制作用,穿心蓮內(nèi)酯對HTh74細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為17.2±2.77 μmol/L,而對HTh74Rdox細(xì)胞的IC50則為25.9±2.43μmo l/L,并且呈時(shí)間和劑量雙重依賴性;穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合阿霉素用藥后阿霉素對HTh74Rdox細(xì)胞的IC50為629.6±19.87 ng/ml,阿霉素的耐藥指數(shù)為5.15±0.32,較單藥使用時(shí)耐藥性有明顯降低。(2)HTh74Rdox細(xì)胞克隆增殖數(shù)量隨穿心蓮內(nèi)酯濃度增加而降低,當(dāng)穿心蓮內(nèi)酯濃度達(dá)到10μmol/L時(shí),HTh74Rdox細(xì)胞的克隆增殖水平顯著下降,克隆的有效率為22.3%(P0.01);當(dāng)穿心蓮內(nèi)酯濃度達(dá)到20μmo l/L時(shí),克隆的有效率僅為5%(P0.01)。(3)HTh74Rdox細(xì)胞中Caspase-3的活性隨著穿心蓮內(nèi)酯濃度的升高而增高,HTh74Rdox晚期凋亡細(xì)胞較對照組明顯增多,當(dāng)穿心蓮內(nèi)酯的濃度為20μmol/L時(shí),細(xì)胞的晚期凋亡率為21.56%。(4)與對照組相比使用不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后的HTh74Rdox細(xì)胞遷徙能力明顯下降,當(dāng)穿心蓮內(nèi)酯濃度達(dá)到10μmol/L時(shí),劃痕的開放面積與對照組相比可達(dá)126.7%,當(dāng)穿心蓮內(nèi)酯濃度達(dá)到20μmol/L時(shí),劃痕的開放面積與對照組相比可達(dá)150.3%,此外還出現(xiàn)了細(xì)胞死亡現(xiàn)象。(5)與對照組相比使用不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細(xì)胞小管分支數(shù)量無明顯變化。(6)與對照組相比使用不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細(xì)胞中多耐藥通道蛋白MDR1及ABCG2的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.05),且成劑量依賴性。(7)與對照組相比使用不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Oct-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.05),且成劑量依賴性。(8)與對照組相比不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細(xì)胞中p-ERK蛋白的表達(dá)水平降低(P0.05),且成劑量依賴性。(9)隨著多巴胺黑色素納米粒子和穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量比的增加,穿心蓮內(nèi)酯的裝載效率均維持在一個(gè)較低的水平。(10)聯(lián)合使用穿心蓮內(nèi)酯和DMNPs抑制HTh74和HTh74Rdox的細(xì)胞活力,較單獨(dú)使用穿心蓮內(nèi)酯對ATC細(xì)胞的抑制作用無明顯差異。結(jié)論:(1)穿心蓮內(nèi)酯能抑制HTh74和HTh74Rdox細(xì)胞的活性,且對于HTh74Rdox細(xì)胞呈藥物劑量和時(shí)間依賴性;穿心蓮內(nèi)酯可抑制HTh74Rdox細(xì)胞的增殖、遷徙,并增加凋亡作用,但對血管形成無明顯抑制作用。(2)穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合阿霉素作用HTh74Rdox細(xì)胞有減藥增效作用,并且可以通過下調(diào)HTh74Rdox細(xì)胞MAPK/ERK信號通路中p-ERK蛋白的表達(dá),抑制多耐藥通道蛋白MDR1及ABCG2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。(3)穿心蓮內(nèi)酯能抑制HTh74Rdox細(xì)胞干細(xì)胞球的形成,降低干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Oct-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平。(4)多巴胺黑色素納米粒子對穿心蓮內(nèi)酯的裝載效率較低。聯(lián)合使用多巴胺黑色素納米粒子和穿心蓮內(nèi)酯較單獨(dú)使用穿心蓮內(nèi)酯抑制ATC細(xì)胞的作用無明顯差異。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

南京中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文??Ｒｅｃｅｐｔｏｒ?Ｔｙｒｏｓｉｎｅ?Ｋｉｎａｓｅ?（ＲＴＫ）??＼?／?ＶＥＧＦＲ１－３，?ＲＥＴ，?ＦＧＦＲ１－３??ＦｕｓｍｎＲＴＫｓｇｌ?｜｜＾〇３＆３??Ｍｌ—鱗??ｍＢＫＨ?ＢＢＢＢ??ｌｉｌｊｌ??圓■?４？＊－＾３１????ｍ＾ｍ?１?ＭＭｆｌ??Ｇｒｏｗｔｈ，?Ｓｕｒｖｉｖａｌ，?Ｉｎｖａｓｉｏｎ??圖１甲狀腺癌中兩種最常見的遺傳學(xué)改變通路：Ｐ１３Ｋ和ＭＡＰＫ??２．１．２?ｐ５３?突變??ｐ５３位于凋亡、侵襲和干細(xì)胞相關(guān)基因的大型網(wǎng)絡(luò)的中心。ｐ５３蛋白由核心ＤＮＡ結(jié)??合結(jié)構(gòu)域（ＤＢＤ）和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域共同組成，是抗腫瘤發(fā)生的主要因子。值得注意的是，??ｐ５３突變不僅取消了腫瘤抑制功能，而且，還經(jīng)常導(dǎo)致新的致瘤驅(qū)動(dòng)活性，這種負(fù)面作??用被稱為功能獲得（ＧＯＦ）?［５］。ｐ５３突變體通過諸如轉(zhuǎn)化生長因子Ｐ受體（ＴＧＦ－（３），表??皮生長因子受體（ＥＧＦＲ）和原癌基因ＭＥＴ的受體增強(qiáng)信號傳導(dǎo)。與野生型ｐ５３不同，??突變ｐ５３蛋白已被證實(shí)能夠逃避蛋白酶降解，從而導(dǎo)致其在腫瘤中的高度穩(wěn)定［６１。Ｐ５３??的失活也被認(rèn)為是晚期甲狀腺腫瘤的標(biāo)志，根據(jù)人類癌癥體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫（ＣＯＳＭＩＣ）??顯示［７］，ＡＴＣ患者中抑癌基因ｐ５３的突變率最高，達(dá)到５４％?（圖２）。??９??

第一章理論研究??ａ．；％??５４％??馨??■?４１％??１，??３０％?Ｉ?Ｉ??ｎ＇?＇??漏?ｅ?Ｈ?＾?Ｂ?１２％?１１％??１０％?＿?ｈ’?圖■?＿?＿?８％?Ｍ??ＴＰ５３?了ＳＲＴ?ＢＲＡＦ?ＡＸｉＮｉ?ＮＲＡＳ?ＣＴＮＮ８：ＬＰｎ（３ＣＡ?｝＞Ｔ￡Ｎ?ＮＦ１?ＥＪＦＩＡＸ?ＫＲＡＳ?ｆｖＴＴＯＲ?Ｔ￥ＨＲ?ＣＤＫＮ２Ａ?ＨＲＡＳ?ＡＫＴ１?ＴＳＣ２?Ｃ０ＫＮ２Ｃ?６ＧＦＲ??圖２甲狀腺未分化癌致癌基因突變分布??２．１．３腫瘤干細(xì)胞的存在??我們的研究證實(shí)，ＡＴＣ細(xì)胞株ＳＷ１７３６、Ｃ６４３、ＨＴｈ７４中存在極小比例（０．４１％－０．８３％）??的富含腫瘤干細(xì)胞（ＣＳＣｓ）的邊緣細(xì)胞群（ＳＰ），這小群細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物０ｃｔ４??和耐藥蛋白ＡＢＣＧ２、ＭＤＲ１等；在阿霉素誘導(dǎo)耐藥的ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ細(xì)胞株中，富含腫瘤??千細(xì)胞的邊緣細(xì)胞群的比例顯著增加至７０％［８］。此后，我們先后比較二甲雙胍與新型抗??腫瘤藥物索拉菲尼對ＡＴＣ細(xì)胞株及ＣＳＣｓ的效果，結(jié)果表明，二甲雙胍與索拉菲尼均有??一定的抗腫瘤及ＣＳＣｓ作用。二甲雙胍可通過抑制細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡等途徑，有效地．??抑制ＡＴＣ細(xì)胞的增殖，減少甲狀腺ＣＳＣｓ的克隆形成率，與阿霉素有明顯協(xié)同作用，可??有效降低阿霉素的耐藥，在富含ＣＳＣｓ的耐藥株中上述作用更加明顯［９］。進(jìn)一步的研究??提示，在二甲雙胍治療的基礎(chǔ)上，索拉菲尼可增強(qiáng)其效果但二甲雙胍、索拉菲尼的??使用劑量己遠(yuǎn)超過臨床常規(guī)用量，故尚無實(shí)際使用價(jià)值。因此，仍需進(jìn)一步尋找有效的??抗ＡＴＣ及ＣＳＣｓ的藥物。??２．２穿心蓮內(nèi)酯及其類似物的抗腫瘤效應(yīng)??２．２．１促進(jìn)癌細(xì)胞周期

〇．〇５表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。??４實(shí)驗(yàn)結(jié)果??４．１穿心蓮內(nèi)酯抑制ＨＴｈ７４、ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ細(xì)胞的活力??４．１．１甲狀腺未分化癌耐藥細(xì)胞株ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ具有阿霉素耐藥性??不同濃度的阿霉素（０、１、１０、１００、１０００、ｌ〇〇〇〇ｎｇ／ｍｌ）處理?ＨＴｈ７４、ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ??細(xì)胞２４小時(shí)，從阿霉素濃度為ｌＯｎｇ／ｍｌ開始，ＨＴｈ７４細(xì)胞活力就受到明顯抑制，且呈明??顯的劑量依賴性，而ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ細(xì)胞在阿霉素為ｌＯＯＯｎｇ／ｍｌ時(shí)細(xì)胞活力才開始受到抑制??（圖１）。通過ＧｒａｐｈＰａｄ７軟件計(jì)算得出在ＨＴｈ７４細(xì)胞中阿霉素的半數(shù)抑制濃度（ＩＣ５０）??為?１２２．５?±６．８９ｎｇ／ｍｌ，而對于?ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ?細(xì)胞，阿霉素的?ＩＣ５〇?則高達(dá)?２０１１．７士?８５．０１?ｎｇ／ｍｌ，??ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ細(xì)胞對阿霉素的耐藥指數(shù)為１６．４５±?１．０８。??１２５ｎ??■?ＨＴｈ７４??＾?１００￣?１?１?Ｏ?ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ??｜７５｜?Ｉ?Ｉ?ｉｌｌ?ｈ??“ｉｌｉｕｍ??Ｄｏｘ（ｎｇ／ｍｌ）?ｏ?１?１０?１００?１０００?１００００??圖１?ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ細(xì)胞的阿霉素耐藥性??３５??
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本文編號：2860384