研究背景與目的:子癇前期(preeclampsia,PE)特指妊娠20周后出現(xiàn)的以高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕卣?可累及腦、眼、肝、腎等多個(gè)器官的妊娠期特有疾病~([1])。子癇前期是妊娠期特有的并發(fā)癥,也是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的主要原因之一。目前子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,但大多數(shù)患者在胎盤娩出后表現(xiàn)為臨床癥狀和體征逐漸消失~([2]),故推測(cè)胎盤的病理改變與子癇前期發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)�，F(xiàn)有研究已證實(shí)多種血清學(xué)指標(biāo)與子癇前期發(fā)病之間存在相關(guān)性,但仍缺乏特異性的檢測(cè)指標(biāo)用于該疾病的早期篩查和疾病嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)~([3])。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾,并以共價(jià)鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子~([4])。因其呈封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu),不易被核酸外切酶RNaseR降解,因此它比線狀RNA更穩(wěn)定~([5])。環(huán)狀RNA具有多種生物學(xué)功能,可以通過充當(dāng)微小RNA(micro RNA,miRNA)海綿、與RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein,RBP)結(jié)合及調(diào)節(jié)親本基因表達(dá)等參與多項(xiàng)生命活動(dòng)的調(diào)控~([6])。近年研究證實(shí),子癇前期孕婦與正常妊娠孕婦相比環(huán)狀RNA表達(dá)譜存在明顯差異~([7]),這些差異表達(dá)的環(huán)狀RNA分子可能參與了子癇前期的發(fā)病過程。目前環(huán)狀RNA在子癇前期發(fā)病過程中的機(jī)制研究仍較少,本課題擬對(duì)子癇前期患者胎盤組織環(huán)狀RNA表達(dá)譜進(jìn)行鑒定和分析,并對(duì)目標(biāo)分子hsa_circ_0015383的作用機(jī)制進(jìn)行初步探索,最后評(píng)價(jià)hsa_circ_0015383作為子癇前期早期診斷生物標(biāo)志物的價(jià)值,旨在為子癇前期的預(yù)防和治療提供新的研究思路。研究方法:1、根據(jù)嚴(yán)格的納入及排除標(biāo)準(zhǔn),選擇子癇前期病例及年齡、孕周、孕產(chǎn)史、孕前BMI與之相匹配的正常妊娠病例各5例,采用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定胎盤組織環(huán)狀RNA表達(dá)譜,采用DeSeq2篩選差異表達(dá)基因,隨后采用多種生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA分子進(jìn)行分析。2、檢測(cè)30例子癇前期胎盤及30例正常妊娠胎盤中hsa_circ_0015383、Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)水平的差異。構(gòu)建SiRNA轉(zhuǎn)染HTR-8/SVNEO細(xì)胞模型,通過MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)及血管生成實(shí)驗(yàn),了解hsa_circ_0015383對(duì)細(xì)胞功能的影響。3、RT-PCR法檢測(cè)31例子癇前期孕婦及78例正常孕婦孕20周時(shí)血清hsa_circ_0015383的表達(dá)水平,根據(jù)RQ值繪制ROC曲線并計(jì)算曲線下面積,評(píng)價(jià)hsa_circ_0015383用于子癇前期早期診斷的價(jià)值。研究結(jié)果:1、在10例胎盤樣本中,我們共檢測(cè)到了5038個(gè)環(huán)狀RNA表達(dá)豐度。以P0.05,差異倍數(shù)≥1.5倍作為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn),共得到差異表達(dá)的環(huán)狀RNA分子277個(gè),包括130個(gè)高表達(dá)的和147個(gè)低表達(dá)的環(huán)狀RNA分子。對(duì)差異環(huán)狀RNA來源基因進(jìn)行G0和KEGG通路富集分析,提示在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、磷脂代謝、RAS信號(hào)通路等方面存在明顯富集現(xiàn)象。2、子癇前期患者胎盤組織中hsa_circ_0015383表達(dá)水平上調(diào)(P0.05),這一結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。應(yīng)用SiRNA下調(diào)hsa_circ_0015383后,HTR-8/SVNEO細(xì)胞中Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)水平升高,細(xì)胞的遷移、侵襲、成管能力增強(qiáng)(P0.05),而細(xì)胞增殖能力無明顯改變(P0.05)。3、hsa_circ_0015383在子癇前期孕婦孕20周時(shí)血清中的表達(dá)水平高于正常妊娠孕婦(P0.05),預(yù)測(cè)子癇前期的曲線下面積為0.813,靈敏度為0.742,特異度為0.756。結(jié)論:1、與正常妊娠胎盤相比,子癇前期胎盤組織中存在異常表達(dá)的環(huán)狀RNA,這些異常表達(dá)的環(huán)狀RNA分子可能通過某些通路參與子癇前期的發(fā)病過程。2、hsa_circ_0015383在子癇前期患者胎盤組織中呈高表達(dá),且其表達(dá)水平與Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。hsa_circ_0015383可能通過與hsa-miR-197結(jié)合對(duì)Wnt信號(hào)通路起負(fù)性調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而影響EVTs細(xì)胞遷移、侵襲和成管能力,最終參與子癇前期發(fā)病。3、hsa_circ_0015383對(duì)子癇前期的早期診斷具有一定的價(jià)值,未來有望成為子癇前期新的生物標(biāo)志物。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R714.244
【部分圖文】：

先前研究中,環(huán)狀RNA被認(rèn)為是一類獨(dú)特的非編碼RNA。近期研究表明,一種名為circZNF609的新型環(huán)狀RNA含有開放閱讀框(open reading frame,ORF),當(dāng)被IRES驅(qū)動(dòng)時(shí)可在小鼠成肌細(xì)胞中翻譯成蛋白質(zhì)。Yang等[47]研究發(fā)現(xiàn),circFBXW7編碼一種新型功能蛋白FBXW7-185a,可通過減少c-Myc抑制膠質(zhì)瘤發(fā)生。盡管已認(rèn)識(shí)到環(huán)狀RNA具有翻譯功能,但這些環(huán)狀RNA編碼的蛋白質(zhì)的功能仍需進(jìn)一步研究。在婦產(chǎn)科領(lǐng)域,對(duì)環(huán)狀RNA的研究起步較晚,環(huán)狀RNA與子癇前期相關(guān)性的研究仍較少,在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用還需不斷探索。在本試驗(yàn)中,我們將采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)子癇前期患者胎盤組織中環(huán)狀RNA表達(dá)譜進(jìn)行鑒定,并從中選出目標(biāo)分子進(jìn)行后續(xù)機(jī)制研究,旨在為子癇前期的早期診斷提供新的生物學(xué)標(biāo)記物,為子癇前期的預(yù)防和治療提供新的切入點(diǎn)。

在本部分試驗(yàn)中,我們將采用基于Illumina測(cè)序平臺(tái)的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)子癇前期患者胎盤組織中環(huán)狀RNA表達(dá)譜進(jìn)行鑒定,測(cè)序生物信息分析流程見圖1-1。具體步驟如下:

對(duì)照組中,胎盤絨毛少見合體細(xì)胞結(jié)節(jié)和纖維性壞死,血管合體膜絨毛較多;而研究組胎盤組織中,絨毛合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增多,毛細(xì)血管充血、纖維性壞死較多,血管合體膜絨毛少,見圖1-2。二、RNA質(zhì)檢結(jié)果
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