研究目的以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路為研究靶點(diǎn),開展護(hù)肝片對(duì)抗結(jié)核藥物導(dǎo)致肝膽濕熱證藥物性肝損傷患者治療效果以及護(hù)肝片中主藥五味子所含有的有效成分——五味子乙素對(duì)抗結(jié)核藥導(dǎo)致的正常肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的研究。探討護(hù)肝片調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路治療藥物性肝損傷的機(jī)制。研究方法1.臨床實(shí)驗(yàn)本研究采用回顧性的研究方法,按照治療方法不同將納入研究的68名抗結(jié)核藥物導(dǎo)致肝膽濕熱證藥物性肝損傷的患者分為治療組和對(duì)照組。兩組患者均采用“2HRZE/4HR”方案進(jìn)行抗結(jié)核治療,對(duì)照組給予單純多烯磷脂酰膽堿膠囊口服治療。治療組在對(duì)照組治療的基礎(chǔ)上,加用護(hù)肝片口服治療。療程為14天。兩組治療期間,觀察兩組患者:①中醫(yī)證候指標(biāo)改善情況,·②肝功能相關(guān)化驗(yàn)指標(biāo):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、堿性磷酸酶、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值的改善情況;③人血清內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白的檢測(cè)指標(biāo):GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP蛋白含量變化情況。2.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)①使用不同濃度的五味子乙素(0、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM)和利福平(0、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM)處理人正常肝 L02 細(xì)胞 48h,通過 MTT實(shí)驗(yàn)確定五味子乙素的保護(hù)濃度和利福平的造模濃度。選擇五味子乙素50μM為細(xì)胞保護(hù)濃度,利福平200μM作為細(xì)胞造模濃度。②實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組:L02細(xì)胞不作任何處理;利福平組:給予L02細(xì)胞200μM利福平;利福平+五味子乙素組:L02細(xì)胞給予50μM五味子乙素和200μM利福平。處理0-72h,MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)L02細(xì)胞的存活率。③200μM利福平處理L02細(xì)胞12 h、24 h和48 h,觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白和基因表達(dá)情況。④實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組:L02細(xì)胞不作任何處理;利福平組:200μM利福平處理L02細(xì)胞48h;利福平+五味子乙素組:200μM利福平和不同濃度五味子乙素(25μM、50μM、100μM)處理L02細(xì)胞48h,采用WB、qRT-PCR、流式細(xì)胞方法分別檢測(cè)各組L02細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白、基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡情況。⑤實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組:L02細(xì)胞不作任何處理;利福平組:給予L02細(xì)胞200μM利福平;利福平+五味子乙素組:L02細(xì)胞給予100μM五味子乙素和200μM利福平。作用48 h后,采用免疫熒光染色方法檢測(cè)上述各組L02細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白表達(dá)。研究結(jié)果1.臨床實(shí)驗(yàn)①治療組與對(duì)照組相比,中醫(yī)證候療效明顯優(yōu)于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。②治療組與對(duì)照組相比,患者治療前后中醫(yī)癥狀積分改善情況明顯優(yōu)于對(duì)照組。③治療組治療1周后,與治療前相比,ALT、ALP明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,TBIL、INR與治療前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果與對(duì)照組治療1周后相比,僅ALT改善更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ALP改善無顯著性差異。治療組治療2周后,與治療前相比,除ALT、ALP外,TBIL水平開始下降,與治療前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與對(duì)照組治療2周后相比,TBIL改善更明顯。INR改善與本組治療前、對(duì)照組治療2周后相比差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④兩組患者治療前血清中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表達(dá)明顯增加。治療組治療1周后,患者血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表達(dá)僅輕度下降,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。治療組治療2周后,患者血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表達(dá)較治療前明顯下降。而對(duì)照組患者治療1、2周后,血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表達(dá)均未出現(xiàn)明顯下降。治療2周后,治療組比較對(duì)照組,患者血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)①利福平+五味子乙素組,比較利福平組,L02細(xì)胞的存活率顯著提高,表明五味子乙素可以減少利福平對(duì)L02細(xì)胞的損害。②利福平可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路并促進(jìn)GRP78、PERK、ATF4、CHOP、ATF6、ARMET、p-IRE1 和 XBP-1 的蛋白質(zhì)表達(dá),同時(shí),利福平促進(jìn)基因GRP78、PERK、ATF4和CHOP mRNA表達(dá)水平,呈時(shí)間依賴性。③WB、qRT-PCR方法提示五味子乙素可以有效地抑制利福平激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路,下調(diào)GRP78、PERK、ATF4、CHOP、ATF6、ARMET和XBP-1蛋白和基因的表達(dá)水平,且抑制作用與五味子乙素濃度呈正相關(guān)。④流式細(xì)胞術(shù)和WB方法提示五味子乙素能有效抑制利福平誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡,降低凋亡蛋白PARP和Cleaved caspase3的表達(dá),且這種抑制作用與五味子乙素濃度呈正相關(guān)。⑤免疫熒光染色方法提示五味子乙素可以有效地抑制利福平激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路,下調(diào)L02細(xì)胞核內(nèi)GRP78、PERK、ATF6、p-IRE1和XBP-1蛋白表達(dá)水平。研究結(jié)論①護(hù)肝片可以有效改善肝膽濕熱證藥物性肝損傷患者中醫(yī)證候。②護(hù)肝片可以有效改善肝膽濕熱證藥物性肝損傷患者肝功能相關(guān)指標(biāo):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、堿性磷酸酶。③護(hù)肝片可以有效地抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白的表達(dá),對(duì)抗結(jié)核藥物導(dǎo)致的藥物性肝損傷起到治療作用。④五味子乙素能夠有效地提高利福平損傷的肝細(xì)胞存活率,減少細(xì)胞凋亡,同時(shí)可以下調(diào) GRP78、PERK、ATF4、CHOP、ATF6、ARMET 和 XBP-1 的表達(dá)水平,抑制利福平激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路,且抑制效果與其作用濃度呈正相關(guān)性。提示其保肝機(jī)制可能是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路來實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

ＡＦＬＤ大鼠對(duì)ＣＣ１４誘導(dǎo)的肝損傷的敏感性，改善大??鼠肝功能，減少肝臟脂肪堆積［３５］。研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑可以減輕乙醇誘導(dǎo)的急性肝??損傷和血清外泌體ｍｉＲ－１２２的表達(dá)，為急性酒精性肝損傷提供了潛在的治療策略［３６］。對(duì)于??全氟辛烷磺酸誘導(dǎo)的肝損傷，通過抑制炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維生素Ｃ也可以起到對(duì)小??鼠的肝保護(hù)作用［３７］。??高爾基休??：：??…ｇ＇：臟始麵－ｒ??’?二?點(diǎn)合成＿分悉自、議５、為網(wǎng)關(guān)??［ＡＪ?Ｈ?聯(lián)降解通路及凋亡相關(guān)Ｂ因轉(zhuǎn)??錄激活??圖１－２內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路圖??（來源于?Ｄｕｆｏｕｒ?ＪＦ．?Ｃｌａｖｉｅｎ?ＰＡ，?Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?Ｐａｔｈｗａｙｓ?ｉｎ?Ｌｉｖｅｒ?Ｄｉｓｅａｓｅｓ?［Ｍ］，?Ｎｅｗ?Ｊｅｒｓｅｙ：??Ｗｉｌｅｙ－ＢＩａｃｋｗｅｌｌ，?２０１５．?ｐ．?１４１）??１．３．２特異質(zhì)肝毒性??肝臟除了是解毒器官，又是免疫器官。在部分特異性個(gè)體中，藥物或其代謝產(chǎn)物在肝??臟中與特異性肝內(nèi)蛋白結(jié)合，形成新的抗原，使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致特異質(zhì)肝毒??性損傷。臨床上，阿莫西林、磺胺甲惡唑、異煙肼等抗微生物制劑，可以激活人體免疫反??應(yīng)，造成肝細(xì)胞損害。同時(shí)，研宄表明肝損害與藥物的給藥劑量、途徑、時(shí)間并無明確關(guān)??系，而且很少重復(fù)出現(xiàn)【３８￣３９】。酪氨酸激酶和ＴＮＦａ抑制劑這些分子靶向治療藥物也有誘導(dǎo)??７??

?南京中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文???３．２護(hù)肝片的質(zhì)量評(píng)定??藥典規(guī)定是取以五味子乙素對(duì)照品，加甲醇制成每ｌｍｌ含Ｉｍｇ的溶液，作為護(hù)肝片的??對(duì)照品溶液［ＩＱ８］進(jìn)行質(zhì)量評(píng)定�，F(xiàn)代藥理學(xué)采用高效液相色譜法（Ｈｉｇｈ?Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ?Ｌｉｑｕｉｄ??Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）對(duì)護(hù)肝片的多成分進(jìn)行含量鑒定，發(fā)現(xiàn)五味子乙素的含量在護(hù)肝??片的有效成分中屬于含量偏高者［１２（Ｕ２１］（圖１－２）。并且五味子乙素的保肝護(hù)肝研究是現(xiàn)在??醫(yī)學(xué)研宄的熱點(diǎn)［１２２４２５］。??｜?（?Ｉ?３?．１??Ｊ??－?Ｉ＿ｋ＿＿＿－?ｉＪ??????——?１?ｉｒｉｎｍ??０?ｔｏ?２０?３０?４０?５０??１．腺苷?２．五味子醇甲?３．五味子酯甲?４．五味子甲素?５．五味子乙素??圖１－２?ＨＰＬＣ色譜圖??（來源于伍國怡．ＨＰＬＣ同時(shí)測(cè)定護(hù)肝片中５種成分的含量［Ｊ］．中國藥師，２０１６，１９：??８７４）??總之，藥物性肝損傷在臨床上并不少見，且對(duì)患者的身體造成危害，嚴(yán)重時(shí)危及生命，??如何找到一個(gè)行之有效且無毒副作用、簡單易行的治療方法顯得尤為重要。祖國傳統(tǒng)中醫(yī)??藥運(yùn)用整體觀念、辨證論治，在防治肝損傷方面有其特色和優(yōu)勢(shì)，具有廣闊應(yīng)用前景。護(hù)??肝片是在臨床多次驗(yàn)證有效的保肝護(hù)肝的中成藥，但其如何達(dá)到治療效果的分子機(jī)制，以??及其所含的有效成分如何作用人體尚不十分清晰。因此，本研究在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，結(jié)??合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，深入探索護(hù)肝片防治ＤＩＬＩ的機(jī)制，以利于該藥更好地服??務(wù)于患者，是本研究的初衷。??１５??

ｗ：?ａ??ｆ＾ｒｒ．?＝?目三?七三?■??〇?￣￣—?０?■■＊—■■■■■■?＇?＊＊?－??〇ｄ?？ｄ?１４ｄ?〇ｄ?７ｄ?１４ｄ??Ｃ?Ｄ??＊＊??６０－．?Ｉ?１?？？?２．°－??？？－?ｊｆ１］?ｉＰｉ?ｒ１！?，?１６－?ｇｒ＇ｎ?Ｓｒ－ｎ??“畫圍ｉ?Ｊ１Ｄ？塵薩１??＂圍圍圍。１麵畫??〇１?ＨＩ?＼—旨?Ｌ－Ｊ—圓?１?１?■?〇〇?Ｉ?圉?Ｉ」—旨?ｆ?—昌?Ｉ?ｉ??０ｄ?７ｄ?�。矗�?０ｄ?７ｄ?１４ｄ??圖２－１兩組患者治療前后肝功能指標(biāo)變化情況比較ｒｐ＜０．０５，?？Ｐ＜０．０１）??３．５兩組患者治療前后人血清內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白指標(biāo)的比較??兩組患者治療前血清中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白ＧＲＰ７８、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６及ＣＨＯＰ??表達(dá)明顯增加。治療組治療１周后，兩組患者血清中ＧＲＰ７８、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６及ＣＨＯＰ??表達(dá)僅輕度下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＞〇．〇５）。治療組治療２周后，患者血清中ＧＲＰ７８、??ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６及ＣＨＯＰ表達(dá)與治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０１）。而??對(duì)照組治療１、２周后，患者血清中ＧＲＰ７８、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＴ６及ＣＨＯＰ表達(dá)均未出現(xiàn)??明顯下降（Ｐ＞０．０５）。治療２周后，治療組比較對(duì)照組，患者血清中ＧＲＰ７８、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、??ＡＴＦ６?及?ＣＨＯＰ?表達(dá)下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＝０＿０３０、Ｐ＝０．０２８、Ｐ＝０．０００、Ｐ＝０．００４、Ｐ＝０．０００）??（表?２－６、圖?２－２）。??３１??
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