砷元素是地殼中的常見化學元素之一,對人類的健康具有一定程度的危害。砷元素的無機形態(tài),尤其是三價氧化態(tài)的亞砷酸鈉(NaAsO_2)和三氧化二砷(As2O3)等的毒性很強。以往的研究表明,長期攝入砷元素含量超標的飲用水會增加罹患皮膚癌、肺癌、肝癌、腎癌在內的多種類型癌癥的發(fā)病風險。此外,人體接觸砷元素還會引發(fā)如Bowen’s病、色素沉著異常等在內的多種皮膚損傷。值得注意的是,砷暴露引發(fā)的皮膚損傷具有5-10年的潛伏期,且在砷暴露停止后的數(shù)十年內相關的疾病仍舊會進一步加重,提示對于砷元素的毒性需要長期預防。當砷元素進入機體后,能夠引起細胞氧化應激,進而導致活性氧(ROS)升高、細胞活力下降、引發(fā)DNA損傷及細胞突變、細胞凋亡。Nrf2是細胞維持氧化還原穩(wěn)態(tài)和對抗氧化應激損傷的關鍵轉錄因子,能夠調節(jié)包括血紅素氧合酶1(HO-1)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、醌氧化還原酶1(NQO-1)和超氧化物歧化酶(SOD)在內的多種抗氧化酶的表達。有研究表明,Nrf2在細胞抗無機砷誘導的氧化應激損傷過程中發(fā)揮了關鍵作用,Nrf2的激活及其調節(jié)的細胞抗氧化物質可以保護Ha Ca T細胞免受砷誘導的細胞凋亡和細胞毒性損傷。因此,激活Nrf2的表達是對抗砷誘導細胞損傷的關鍵。一些前期研究證明了天然化合物紫檀芪(Pterostilbene,Pts)具有優(yōu)秀的抗氧化作用。紫檀芪可以降低包括過氧化氫和超氧陰離子在內的活性氧活性;可以使得不同細胞系過氧化氫酶的表達增加,如總谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶,超氧化物歧化酶等。紫檀芪可能通過激活Nrf2等多個相互關聯(lián)的機制發(fā)揮其抗氧化作用。通過抗氧化作用,Pts能夠調節(jié)并改善靶細胞的抗氧化應激水平,保護細胞免于各種因素導致的細胞凋亡、壞死等細胞損傷。因此,在這項研究中,我們通過細胞活性試驗研究了Pts對NaAsO_2誘導的細胞毒性的保護作用;通過DCFH-DA熒光檢測方法檢測了Pts對NaAsO_2誘導的細胞內ROS水平升高的緩解作用;通過檢測細胞內丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)水平,測定了Pts的抗氧化作用;通過JC-1法檢測線粒體膜電位水平研究了Pts對NaAsO_2誘導的線粒體損傷的保護作用;通過免疫印跡法檢測了Pts對細胞色素C(Cytochrome C)表達的調節(jié)作用;通過流式細胞術檢測了Pts對NaAsO_2誘導的細胞凋亡的抑制作用。之后,在體內試驗中,我們給予小鼠自由飲用含有NaAsO_2的飲水進行染毒,之后給予不同劑量的Pts對小鼠進行治療,通過檢測小鼠在實驗期間的體重變化、臟器系數(shù)變化、肝臟及皮膚的病理組織學變化、脾臟及胸腺淋巴細胞亞群的變化等指標,研究了Pts對NaAsO_2誘導的小鼠亞慢性砷中毒模型的保護作用;進一步,我們通過研究Pts對NaAsO_2誘導的細胞內線粒體功能和凋亡相關蛋白的調節(jié)作用確定了Pts的作用靶點;最后通過si RNA轉染技術敲低了Nrf2的表達,研究了Pts對NaAsO_2誘導細胞損傷的保護作用機制。結果表明:Pts在受試濃度范圍內對細胞活力無顯著影響,但對NaAsO_2誘導的細胞毒性具有極顯著的保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),Pts可以降低由NaAsO_2誘導的細胞內ROS水平的升高、降低NaAsO_2誘導的細胞內MDA水平、提高細胞內的SOD水平、降低線粒體膜電位去極化率、抑制NaAsO_2誘導的線粒體中細胞色素C(Cytochrome C)向胞質部分的釋放、顯著抑制NaAsO_2誘導的細胞凋亡和壞死,進而對細胞產(chǎn)生保護作用。體內試驗中,我們發(fā)現(xiàn)Pts能夠緩解NaAsO_2染毒后造成的小鼠增重下降及小鼠肝臟系數(shù)下降、緩解NaAsO_2染毒后造成的小鼠肝臟損傷及皮膚角質化,并顯著逆轉NaAsO_2染毒造成的小鼠脾臟及胸腺淋巴細胞CD4/CD8的比值下降,保護小鼠的免疫功能。進一步研究發(fā)現(xiàn),Pts可誘導腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated kinase,AMPK)和AKT磷酸化,使Nrf2從細胞質向細胞核轉移,上調Nrf2下游NQO1和HO-1的表達;Pts可以上調NaAsO_2抑制的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表達,下調NaAsO_2激活的促凋亡相關蛋白Bax、Bad和Caspase 3的蛋白表達。在Nrf2敲低的細胞中,Pts對NaAsO_2誘導的細胞毒性及ROS生成的抑制作用大幅減弱,說明Nrf2是Pts發(fā)揮抗氧化作用的關鍵蛋白,Pts通過激活Nrf2途徑發(fā)揮對NaAsO_2誘導細胞損傷的保護作用。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)了Pts對NaAsO_2誘導的表皮細胞損傷具有顯著的保護作用,能夠緩解NaAsO_2染毒對小鼠造成的危害,保護小鼠的免疫功能。進一步研究發(fā)現(xiàn),Nrf2是Pts發(fā)揮上述作用的關鍵轉錄因子,Pts通過激活Nrf2信號通路并調節(jié)抗氧化物質的表達,從而保護細胞免于NaAsO_2誘導的細胞損傷。我們的研究對Pts的抗氧化作用提供了研究基礎。Pts在預防和治療由砷暴露引起的皮膚損傷和其他疾病方面具有潛在的應用價值。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

Nrf2由nuclear factor,erythroid-derived 2-like 2(NFE2L2)基因編碼,含有6個結構域(圖2.1)[86],其中Neh1區(qū)域含有一個堿性亮氨酸拉鏈(basic region-leucine zipper,bZIP),當Nrf2轉位進入細胞核內,bZIP有助于Nrf2與小Maf蛋白(small Maf proteins,sMafs)形成二聚體,并能夠幫助Nrf2識別并結合抗氧化反應原件(antioxidant-response-element,ARE),進而啟動下游相關基因的轉錄。Neh2及Neh6是降解決定子,其中,Neh2含有兩個保守的區(qū)域DLGex和ETGE,是Nrf2與Keap1的結合區(qū),有助于Nrf2與Keap1的結合,并幫助Nrf2穩(wěn)定存在于細胞質中不被降解;而Neh6是Nrf2與β-TrCP的結合區(qū)。Neh3位于C端,與ARE對相關基因轉錄的調控過程相關。Neh4和Neh5區(qū)是參與啟動下游相關基因轉錄的結構域,當Nrf2轉位進入細胞核內,需要Neh4及Neh5負責激活Nrf2依賴的轉錄過程[87-89]。作為細胞抗氧化應激反應的主要調節(jié)劑,Nrf2的表達受到嚴格的調控。在健康條件下,Nrf2的mRNA持續(xù)表達,使得Nrf2的表達控制在蛋白水平[90]。蛋白翻譯之后,Nrf2主要存在于細胞質中,和Kelch-like ECH-associated protein1(Keap1)結合,形成抑制自身活性的復合物。當受到外界因素(如親電子物質或者ROS等)刺激時,刺激因素修飾Keap1的半胱氨酸殘基,使得Keap1的空間構象發(fā)生改變,進而使得Nrf2-Keap1的復合物發(fā)生解離,釋放出Nrf2[91]。Nrf2轉位進入細胞核以后,和ARE結合,繼而激活下游相關基因的轉錄,表達產(chǎn)生一系列抗氧化應激相關的蛋白質,有助于細胞對抗氧化應激造成的細胞損傷[92]。

Nrf2在調節(jié)線粒體功能中具有重要作用。研究表明,Nrf2參與線粒體膜電位的調節(jié)以及ATP的合成。在一份來自于原代小鼠肝臟細胞的蛋白質組學分析研究中,Nrf2的激活能夠調節(jié)ATP合酶α亞基的表達[106]。在氧化應激條件下,Nrf2介導的解偶聯(lián)蛋白3的表達能夠提高線粒體內膜的質子傳導率,從而減少超氧化物的形成[107]。當Nrf2缺失時,蘋果酸酶1、異檸檬酸脫氫酶1、葡萄糖6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶的表達降低,進而導致NADPH的表達水平降低。HADPH的表達水平降低進一步引起細胞內氧化型谷胱甘肽轉變?yōu)檫�原性谷胱甘肽的效率降低,導致細胞轉化為氧化態(tài),最終引起炎癥及細胞死亡[108,109]。Nrf2在線粒體的生物發(fā)生過程中也很重要。有研究表明,在缺乏Nrf2的肝臟細胞中,線粒體DNA的數(shù)量明顯低于野生型細胞內線粒體DNA的數(shù)量[110]。此外,Nrf2對于線粒體的完整性具有調控作用,研究發(fā)現(xiàn),通過給予Nrf2激活劑蘿卜硫素處理,能夠保護大鼠腦部來源的線粒體免于過氧化物誘導的線粒體通透性的增加,且這一保護作用與蘿卜硫素作用下的線粒體谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶1、蘋果酸酶3和硫氧還蛋白2的增加密切相關[111,112]。在動物體內,敲除nrf2基因的小鼠雖然能夠正常發(fā)育,但是對外界氧化性刺激的敏感性大幅提高,提示Nrf2在小鼠抗氧化應激過程中扮演關鍵角色[113,114]。最后,在氧化應激過程中,Nrf2也能夠通過調節(jié)細胞自噬體的降解作用來清除受損的線粒體,充分說明了Nrf2在線粒體調控中具有重要的作用[115,116]。

紫檀芪(Pterostilbene,Pts)是一種多酚類化合物,屬于白藜蘆醇的二甲基化衍生物,主要存在于藍莓、葡萄、花生、紫檀等植物中,相較于其同系物白藜蘆醇,Pts具有更高的親脂性、更好的生物利用度及更優(yōu)秀的生物學活性[124-127]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)Pts具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂、降血糖等多種有益于人體健康的生物學活性,是天然化合物抗氧化研究的熱點[128-141]。3.1 紫檀芪的藥理作用
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本文編號：2858573