T系急性淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)是一種以胸腺T細(xì)胞發(fā)育障礙為特點(diǎn)的具有侵略性的腫瘤疾病,約占兒科急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL)病例的10%-15%和成人病例的25%。盡管采用了新的聯(lián)合化療方案,但只有70-80%的兒童和40%的成年患者能達(dá)到長(zhǎng)期緩解,因此T-ALL預(yù)后仍然極差。Hedgehog (Hh)信號(hào)通路在胚胎發(fā)育和成年組織穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。經(jīng)典Hh信號(hào)通路是Hh配體,其中包括SHH (Sonic hedgehog), DHH (Desert hedgehog)和IHH (Indian hedgehog),與跨膜蛋白受體PTCH (Patched)相結(jié)合,進(jìn)而激活第二個(gè)跨膜蛋白SMO (Smoothened),活化的SMO導(dǎo)致GLI蛋白穩(wěn)定和核內(nèi)積累。GLI家族包括GLI1 (GLI family zinc finger 1), GLI2 (GLI family zinc finger 2)和GLI3 (GLI family zinc finger 3)。有充分的證據(jù)表明,異�；罨腍h信號(hào)與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。與SMO拮抗劑環(huán)巴胺相比,GLI抑制劑GANT58和GANT61可以更有效的誘導(dǎo)一些癌細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯和凋亡,如髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞,結(jié)腸癌細(xì)胞,橫紋肌肉瘤細(xì)胞,ovine鱗狀腫瘤細(xì)胞和慢性白血病細(xì)胞等。但Hh信號(hào)通路及GLI抑制劑在T-ALL中的作用尚未有研究報(bào)道。此外,最近的調(diào)查結(jié)果顯示磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B (Protein kinase B, PKB/AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶基因(Mammalian target of rapamycin, mTOR)信號(hào)通路持續(xù)活化是T-ALL的共同特征。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(Phosphatase and tensin homolog, PTEN)的基因水平或翻譯后的失活在T-ALL中普遍存在,PTEN失活導(dǎo)致PI3K/AKT/mTOR通路持續(xù)活化。該信號(hào)通路在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),生存和自噬等方面發(fā)揮核心作用。哌立福新(Perifosine)是一種新的烷基磷脂類似物,能夠阻止AKT膜定位和磷酸化,從而抑制AKT活性。該藥物在許多臨床前模型顯示出抗腫瘤活性,而且目前已進(jìn)入多種癌癥的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期臨床試驗(yàn),如慢性淋巴細(xì)胞白血病,腎細(xì)胞癌,卵巢癌,多發(fā)性骨髓瘤和結(jié)腸直腸癌等。然而,哌立福新的抗腫瘤分子機(jī)制尚未完全闡明。在本研究中,我們利用GLI和AKT抑制劑探討Hh和AKT信號(hào)通路在T-ALL細(xì)胞中的作用,兩條通路的交互作用,及不同藥物聯(lián)合應(yīng)用的潛在細(xì)胞毒性和作用機(jī)理。第一部分GANT58抑制Hh信號(hào)誘導(dǎo)T-ALL細(xì)胞凋亡,并與AKT抑制劑有協(xié)同作用Hh和AKT信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活方面起至關(guān)重要的作用,而這些通路的失調(diào)可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。我們使用了四種不同的T-ALL細(xì)胞系：CCRF-CEM細(xì)胞系,Jurkat細(xì)胞系,人類CEM克隆細(xì)胞系C7-14和C1-15,并選擇不同的信號(hào)抑制劑來(lái)研究?jī)蓷l通路在T-ALL的表達(dá)情況及功能。1.Hh通路關(guān)鍵信號(hào)因子在不同T-ALL細(xì)胞系中普遍表達(dá)。使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR (real-time RT-PCR)檢測(cè)到Hh受體PTCH1和SMO, GLI及GLI抑制蛋白SUFU (Suppressor of Fused)在4種細(xì)胞系中均有表達(dá)。使用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot, WB)檢測(cè)出在T-ALL細(xì)胞系中GLI1蛋白存在兩個(gè)變異體(GLI1△N和GLI1FL)。GLI1△N在所有T-ALL細(xì)胞系中均有表達(dá),但CCRF-CEM, CEM7-14和CEM1-15細(xì)胞系表達(dá)很低。GLI1FL在CCRF-CEM, CEM7-14和CEM1-15細(xì)胞表達(dá)很強(qiáng),但在Jurkat細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到。2.SMO拮抗劑環(huán)巴胺對(duì)T-ALL細(xì)胞只有微弱的細(xì)胞毒性,GANT58則表現(xiàn)出較強(qiáng)細(xì)胞毒作用。T-ALL細(xì)胞對(duì)低濃度(1pM或3pM)環(huán)巴胺不敏感。而GANT58減少了Hh通路靶基因PTCH1及GLI1的表達(dá),并有效的降低了T-ALL細(xì)胞的活力,增加了細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)了細(xì)胞周期停滯。這些細(xì)胞系對(duì)GANT58敏感性的順序是CEM1-15 CEM7-14 CCRF-CEMJurkat,這一順序與GLI1在細(xì)胞系中的表達(dá)水平一致。3.哌立福新下調(diào)T-ALL細(xì)胞Hh/GLI通路活性,同時(shí)抑制MEK/ERK信號(hào)通路可增強(qiáng)該效果。哌立福新降低p-AKT, p-GSK3β及GLI1表達(dá)水平,呈劑量依賴性,并且哌立福新增加了ERK1/2磷酸化水平。用MEK/ERK抑制劑PD98059預(yù)處理,可以提高哌立福新對(duì)GLI1的下調(diào)幅度達(dá)20%-30%。4.AKT抑制劑與GANT58協(xié)同殺傷T-ALL細(xì)胞。利用Chou-Talalay方法,我們發(fā)現(xiàn)低濃度GANT58與哌立福新或GSK690693聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同誘導(dǎo)T-ALL細(xì)胞死亡。這些結(jié)果表明,GANT58并AKT抑制劑與現(xiàn)有的癌癥治療方法聯(lián)合使用,可能是治療更多惡性腫瘤的有效方法之一。第二部分哌立福新通過(guò)AKT/GSK3β和MEK/ERK途徑誘導(dǎo)T-ALL細(xì)胞保護(hù)性自噬,與氯喹有協(xié)同效應(yīng)自噬是細(xì)胞自身蛋白或細(xì)胞器在溶酶體中的降解過(guò)程,以此實(shí)現(xiàn)回收和周轉(zhuǎn)細(xì)胞成分,維持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。許多研究表明,自噬的失調(diào)與人類一些疾病相關(guān),如腫瘤的發(fā)生。自噬在腫瘤細(xì)胞中的作用很復(fù)雜。在癌癥的治療中,它既可以促進(jìn)細(xì)胞的生存,又可以加速細(xì)胞死亡。自噬發(fā)揮不同,甚至相反的作用,取決于以下情況的不同,如腫瘤的類型,腫瘤的發(fā)展階段及治療的性質(zhì)和程度。哌立福新對(duì)T-ALL細(xì)胞自噬的影響尚未有研究。在本研究中,我們集中探討在T-ALL中哌立福新是否通過(guò)PI3K/AKT或絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路影響自噬,以及自噬在哌立福新誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中的作用。1.哌立福新降低T-ALL細(xì)胞生存率和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。哌立福新抑制CCRF-CEM, CEM7-14, CEM1-15和Jurkat細(xì)胞的生長(zhǎng),其24小時(shí)50%抑制率(IC50)分別為15.02,13.08,18.06和21.35(pM)。四個(gè)細(xì)胞系對(duì)哌立福新的敏感性順序：CEM7-14 CCRF-CEM CEM1-15 Jurkat。在哌立福新處理的4種細(xì)胞系中,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinylaspartate specific proteinase 3, caspase 3)被激活,呈劑量依賴性,這表明哌立福新誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加。2.哌立福新誘導(dǎo)T-ALL細(xì)胞自噬增強(qiáng),呈劑量依賴性。在CEM7-14和CEM1-15細(xì)胞中,哌立福新誘導(dǎo)LC3-1向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化；在CCRF-CEM和Jurkat細(xì)胞中,哌立福新同時(shí)降低LC3-1和LC3-Ⅱ的水平。3.溶酶體抑制劑氯喹(Chloroquine, CQ)抑制自噬作用,增加了T-ALL細(xì)胞對(duì)哌立福新治療的敏感性,增強(qiáng)了哌立福新誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力。與單獨(dú)使用哌立福新相比,CQ與其合用使細(xì)胞死亡率增加10%-30%。4.哌立福新在T-ALL細(xì)胞中抑制AKT/GSK3P通路和活化MEK/ERK通路；哌立福新通過(guò)激活MEK/ERK信號(hào)而誘導(dǎo)自噬。哌立福新抑制p-AKT和p-GSK3β的表達(dá),誘導(dǎo)ERKI/2磷酸化的增加,呈劑量依賴性,同時(shí)伴隨著Caspase3和LC3的改變。MEK/ERK抑制劑PD98059預(yù)處理T-ALL細(xì)胞阻斷了哌立福新增強(qiáng)自噬的作用,強(qiáng)化了哌立福新導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R733.71
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號(hào)及縮略語(yǔ)
主要試劑及來(lái)源
第一部分 GANT58抑制Hedgehog信號(hào)誘導(dǎo)急性T淋巴白血病細(xì)胞凋亡,并與AKT抑制劑有協(xié)同作用
    前言
    實(shí)驗(yàn)方法
    結(jié)果
    討論
    參考文獻(xiàn)
第二部分 哌立福新通過(guò)AKT/GSK3β和MEK/ERK途徑誘導(dǎo)急性T淋巴白血病細(xì)胞保護(hù)性自噬,與氯喹有協(xié)同效應(yīng)
    前言
    實(shí)驗(yàn)方法
    結(jié)果
    討論
    參考文獻(xiàn)
結(jié)論
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號(hào)：2855676