發(fā)布時(shí)間：2020-10-25 00:32

　　 NK細(xì)胞是機(jī)體天然免疫的關(guān)鍵組分,占外周淋巴細(xì)胞的5~10%。它是機(jī)體免疫防御的第一道防線,在早期惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、病毒和胞內(nèi)寄生菌、真菌的清除以及母胎界面的形成中具有關(guān)鍵作用。NK細(xì)胞的這些作用既可通過(guò)直接的細(xì)胞毒殺傷作用,也可通過(guò)其分泌的細(xì)胞因子如IFN-γ等參與調(diào)控適應(yīng)性免疫而實(shí)現(xiàn)。小鼠NK細(xì)胞的發(fā)育主要源自于骨髓的造血干細(xì)胞,經(jīng)共同淋巴祖細(xì)胞向NK祖細(xì)胞分化(precursor NK,pNK,CD122+NK1.1-DX5-)。p NK通過(guò)不成熟NK細(xì)胞(immature NK,i NK,CD122+NK1.1+DX5-)向成熟NK細(xì)胞(mature NK,mNK,CD122+NK1.1+DX5+)發(fā)育。當(dāng)小鼠NK細(xì)胞獲得表面標(biāo)志NK1.1分子后,根據(jù)表面受體CD11b和CD27的表達(dá)水平,依次由CD11b-CD27+向CD11b+CD27+而最終形成CD11b+CD27-終末成熟NK細(xì)胞。NK細(xì)胞發(fā)育與功能的正常發(fā)揮依賴于內(nèi)源性、外源性因子;正向、負(fù)向轉(zhuǎn)錄因子的相互平衡。外源性因子主要包括正向的介素-15(IL-15)和負(fù)向的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β),而內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄因子主要包括調(diào)控NK細(xì)胞早期發(fā)育、促進(jìn)pNK形成的Ikaros,Pu.1,Ets1和維生素D3調(diào)節(jié)蛋白1(VDUP-1);促進(jìn)i NK形成的E4BP4,Id2和MEF;促進(jìn)NK細(xì)胞終末成熟的GATA3、Tbx21、Eomes和Irf2。但是目前這些發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子均為正向調(diào)控NK細(xì)胞發(fā)育與成熟,而對(duì)NK細(xì)胞的內(nèi)源性負(fù)性調(diào)控因子的認(rèn)識(shí)仍處于初始階段。作為調(diào)控NK細(xì)胞終末成熟關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,Tbx21基因敲除小鼠(Tbx21-/-)終末期CD11b+CD27-NK細(xì)胞亞群幾乎缺失,但其上游信號(hào)通路目前知之甚少。NK細(xì)胞是細(xì)胞因子IFN-γ的主要細(xì)胞來(lái)源,而IFN-γ在機(jī)體抵抗病毒入侵和腫瘤發(fā)生中具有重要作用。NK細(xì)胞IFN-γ分泌缺陷與腫瘤、感染易感性呈正相關(guān)。利用IL-2、IL-12等細(xì)胞因子刺激NK細(xì)胞或人重組IFN-γ增加體內(nèi)IFN-γ水平進(jìn)行臨床腫瘤治療的探索,雖有一定的治療效果,但由于其嚴(yán)重的毒副作用而令人失望。因此尋找新的化合物激活NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ而降低其體內(nèi)毒性具有非常重要的臨床意義�；谏鲜鑫覀兲岬降腘K細(xì)胞發(fā)育與功能調(diào)控研究領(lǐng)域中的兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題,我們從內(nèi)源性因子-轉(zhuǎn)錄因子foxo1和外源性因素-天然化合物phyllanthusminc(pl-c)兩個(gè)方面,深入探討nk細(xì)胞發(fā)育與功能的調(diào)控新機(jī)制,并尋找激活nk細(xì)胞ifn-γ分泌的新策略、新分子。方法與結(jié)果:1.foxo1對(duì)nk細(xì)胞發(fā)育與功能的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制研究foxo1在細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、凋亡、自噬和抗氧化應(yīng)激等方面具有重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)foxo1參與造血干細(xì)胞、共同淋巴祖細(xì)胞的生成,以及t、b細(xì)胞的發(fā)育與功能的調(diào)控,且在不同細(xì)胞中對(duì)靶基因的調(diào)控作用具有高度的細(xì)胞背景特異性。但是其在nk細(xì)胞中的作用目前尚未見(jiàn)研究報(bào)道。我們通過(guò)一系列的體內(nèi)、外模型研究發(fā)現(xiàn):(1)foxo1缺陷減少了nk細(xì)胞向外周淋巴節(jié)的歸巢,其機(jī)制可能與cd62l低表達(dá)有關(guān)為了研究foxo1對(duì)nk細(xì)胞發(fā)育與功能的影響,我們首先通過(guò)ncr1icre小鼠與foxo1fl/fl小鼠(含有floxedfoxo1等位基因)雜交構(gòu)建了nk細(xì)胞foxo1特異性敲除(foxo1?nk)的小鼠模型。foxo1敲除后對(duì)骨髓、脾臟中nk細(xì)胞的比例、數(shù)量無(wú)明顯影響,但是顯著降低外周淋巴結(jié)nk細(xì)胞的比例和數(shù)量,且顯著降低淋巴細(xì)胞歸巢關(guān)鍵因子cd62l的表達(dá)。(2)foxo1以干細(xì)胞內(nèi)源性的方式抑制nk細(xì)胞終末成熟foxo1?nk小鼠骨髓、脾臟、外周淋巴結(jié)和外周血終末成熟cd11b+cd27-nk細(xì)胞比例明顯增加,cd27表達(dá)降低,且終末成熟cd43+klrg+nk細(xì)胞比例增加。通過(guò)骨髓移植將野生型小鼠或foxo1?nk小鼠骨髓細(xì)胞移植至cd45.1同背景野生型小鼠中我們發(fā)現(xiàn)foxo1抑制了nk細(xì)胞成熟的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。而通過(guò)將野生型小鼠和foxo1?nk小鼠骨髓細(xì)胞以等比例的方式移植至同一rag2-/-il2rg-/-小鼠體內(nèi)構(gòu)建嵌合體小鼠發(fā)現(xiàn)foxo1以干細(xì)胞內(nèi)源性的方式調(diào)節(jié)nk細(xì)胞的成熟。(3)foxo1抑制nk細(xì)胞ifn-γ分泌和腫瘤直接靶向殺傷作用foxo1?nk小鼠脾臟細(xì)胞在體外被il-12與il-18聯(lián)合刺激后分泌ifn-γ的nk細(xì)胞比例無(wú)明顯改變,但單個(gè)nk細(xì)胞分泌ifn-γ強(qiáng)度明顯增加;人nk細(xì)胞株nkl無(wú)論是持續(xù)過(guò)表達(dá)、可誘導(dǎo)性表達(dá)或敲低foxo1均以相同的方式影響ifn-γ的生成。foxo1敲除顯著升高小鼠nk細(xì)胞對(duì)yac-1的體外直接靶向殺傷作用,而過(guò)表達(dá)foxo1顯著抑制nkl細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞k562的直接靶向殺傷作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)foxo1敲除明顯抑制了小鼠b16f10細(xì)胞在體內(nèi)向肺臟轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。(4)促炎因子或腫瘤刺激促進(jìn)nk細(xì)胞foxo1的磷酸化而使其失活foxo1磷酸化后從細(xì)胞核向胞漿轉(zhuǎn)移而失去其轉(zhuǎn)錄活性。nk細(xì)胞發(fā)育與功能的關(guān)鍵細(xì)胞因子il-2、il-12和il-15迅速誘導(dǎo)人nk92細(xì)胞和小鼠nk細(xì)胞foxo1磷酸化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠b16f10黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)接種1周后肺臟nk細(xì)胞foxo1磷酸化水平明顯增高。(5)機(jī)制研究上發(fā)現(xiàn)foxo1直接結(jié)合人tbx21dna啟動(dòng)子區(qū)域而通過(guò)與sp1的蛋白相互作用間接結(jié)合到小鼠tbx21dna啟動(dòng)子sp1的結(jié)合位點(diǎn)而抑制sp1對(duì)tbx21表達(dá)的促進(jìn)作用。我們發(fā)現(xiàn)foxo1mrna和蛋白表達(dá)隨著小鼠nk細(xì)胞的成熟依次降低而tbx21的表達(dá)方式與其恰恰相反。foxo1敲除后小鼠nk細(xì)胞tbx21mrna和蛋白表達(dá)顯著增高,而nkl細(xì)胞過(guò)表達(dá)或敲低foxo1均可負(fù)向調(diào)節(jié)tbx21的表達(dá)。通過(guò)chip實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在人nk細(xì)胞中foxo1可直接結(jié)合到tbx21啟動(dòng)子區(qū)域forkhead共有序列上,而通過(guò)ip和chip實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠nk細(xì)胞中foxo1只能以間接的方式被轉(zhuǎn)錄因子sp1招募至tbx21近端啟動(dòng)子sp1的dna結(jié)合區(qū)域而實(shí)現(xiàn)對(duì)tbx21表達(dá)的抑制作用。(6)通過(guò)遺傳學(xué)方式證實(shí)foxo1對(duì)nk細(xì)胞成熟的抑制作用必需通過(guò)其對(duì)tbx21表達(dá)的抑制性調(diào)節(jié)為了進(jìn)一步研究foxo1對(duì)nk細(xì)胞成熟的抑制作用與tbx21的關(guān)系,我們通過(guò)遺傳學(xué)手段將foxo1?nk小鼠與tbx21-/-雜交,獲得tbx21-/-和tbx21+/-foxo1缺陷小鼠,即tbx21-/-foxo1?nk(tbx21敲除純合子,無(wú)tbx21表達(dá))和tbx21+/-foxo1?nk(tbx21敲除雜合子,tbx21低表達(dá))。通過(guò)對(duì)上述小鼠nk細(xì)胞成熟狀態(tài)的分析我們發(fā)現(xiàn)在有tbx21存在的情況下(無(wú)論是野生型還是tbx21雜合子小鼠),foxo1敲除(tbx21+/-foxo1?nk小鼠)可促進(jìn)nk細(xì)胞終末成熟,但當(dāng)tbx21缺失的情況下(即tbx21純合子小鼠,無(wú)tbx21表達(dá)),foxo1敲除(tbx21-/-foxo1?nk小鼠)對(duì)nk細(xì)胞的成熟則無(wú)明顯影響。這說(shuō)明foxo1抑制nk細(xì)胞成熟必需通過(guò)抑制tbx21的表達(dá)。2.天然化合物pl-c促進(jìn)人nk細(xì)胞ifn-γ分泌及相關(guān)機(jī)制研究為了尋找更多的nk細(xì)胞激活途徑,改善目前臨床上提高體內(nèi)ifn-γ水平的治療策略的毒副作用,本論文通過(guò)對(duì)近50多種天然化合物單體進(jìn)行篩選,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)源自木酚素植物提取物的小分子化合物phyllanthusminc(pl-c)可顯著增加人nk細(xì)胞ifn-γ的分泌。(1)pl-c促進(jìn)人cd56bright和cd56dimnk細(xì)胞ifn-γ轉(zhuǎn)錄和分泌在細(xì)胞因子il-12、il-15存在或不存在的情況下,pl-c均可增加健康人外周血外周單個(gè)核細(xì)胞(pmbc)、富集nk細(xì)胞中ifn-γ+nk細(xì)胞比例;通過(guò)純化的nk細(xì)胞(≥99.5%)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在il-12、il-15存在或不存在的情況下pl-c均可直接促進(jìn)cd56bright和cd56dimnk細(xì)胞ifn-γmrna合成和蛋白分泌,且與il-12具有協(xié)同效應(yīng)。(2)pl-c對(duì)人nk細(xì)胞直接靶向殺傷作用及t細(xì)胞ifn-γ分泌均無(wú)明顯影響為進(jìn)一步研究pl-c對(duì)nk細(xì)胞殺傷功能的影響,我們采用純化nk細(xì)胞進(jìn)行體外靶細(xì)胞直接殺傷實(shí)驗(yàn)分析。我們發(fā)現(xiàn)nk細(xì)胞在il-12或il-15存在的情況下,pl-c對(duì)nk細(xì)胞高毒性的靶細(xì)胞k562或低毒性作用的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株arh-77的直接細(xì)胞殺傷作用均無(wú)明顯影響。為了分析pl-c對(duì)人nk細(xì)胞ifn-γ分泌是否具有細(xì)胞特異性,我們接下來(lái)觀察了在il-12或il-15存在的條件下,pl-c對(duì)cd4+和cd8+t細(xì)胞的ifn-γ分泌是否有促進(jìn)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pl-c對(duì)cd4+和cd8+tifn-γ+細(xì)胞比例無(wú)顯著影響。(3)pl-c通過(guò)nf-κb信號(hào)通路促進(jìn)nk細(xì)胞ifn-γ分泌為進(jìn)一步研究pl-c促進(jìn)nk細(xì)胞ifn-γ分泌的機(jī)制,我們綜合分析了既往報(bào)道的參與nk細(xì)胞ifn-γ分泌的主要信號(hào)通路。我們發(fā)現(xiàn)在il-12或il-15存在的情況下,pl-c對(duì)il-12、il-15的受體(il-12rβ1、il-12rβ2、il-15rα、il-15rβ)及其下游信號(hào)通路t-bet、stat家族等蛋白均無(wú)顯著影響。而不論il-12、il-15是否存在,pl-c均可顯著促進(jìn)nf-κbp65的磷酸化,而對(duì)p65mrna和總蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響。且nf-κb特異性抑制劑甲苯磺�；�-l-苯丙氨酸氯甲基酮(tpck)可顯著抑制pl-c對(duì)人原代nk和細(xì)胞株nkl細(xì)胞ifn-γ分泌的促進(jìn)作用。通過(guò)凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(emsa)和染色質(zhì)免疫共沉淀(chip)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)pl-c可顯著促進(jìn)p65結(jié)合到ifngdna啟動(dòng)子c3-33pκb位點(diǎn)上。(4)tlr-nf-κb信號(hào)軸介導(dǎo)pl-c對(duì)nk細(xì)胞ifn-γ分泌的促進(jìn)作用在免疫細(xì)胞接受外界因子刺激后tlr-nf-κb信號(hào)軸對(duì)大量細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有重要作用,而nk細(xì)胞中表達(dá)較高水平的tlr1、tlr3和tlr6。為進(jìn)一步分析toll樣受體(tlr)在pl-c促進(jìn)nk細(xì)胞ifn-γ分泌中的作用,我們采用了抑制性抗體阻滯tlr信號(hào)、tlr激動(dòng)劑、雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)和tlr1shrna等方法證實(shí)了tlr介導(dǎo)的nf-κb激活。通過(guò)使用tlr1、tlr3或tlr6抗體來(lái)阻斷tlrs信號(hào),我們發(fā)現(xiàn)tlr1、tlr6抗體可顯著抑制pl-c對(duì)nk細(xì)胞ifn-γ分泌的促進(jìn)作用和p65磷酸化。pl-c還可促進(jìn)tlr1/2和tlr6激動(dòng)劑對(duì)nk細(xì)胞ifn-γ分泌的激動(dòng)作用。在hek293t細(xì)胞中構(gòu)建同時(shí)過(guò)表達(dá)tlr1或tlr6、pgl-3κb-luc報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng),我們發(fā)現(xiàn)pl-c可直接通過(guò)tlr1或tlr6增加nf-κb對(duì)κb位點(diǎn)的結(jié)合,且有一定的劑量依賴趨勢(shì)。通過(guò)shrna敲低nkl細(xì)胞中tlr1的表達(dá)可抑制pl-c對(duì)ifn-γ分泌的促進(jìn)作用,這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步明確了pl-c激活tlr-nf-κb信號(hào)軸在促進(jìn)nk細(xì)胞ifn-γ分泌中的作用。研究結(jié)論:1.foxo1對(duì)nk細(xì)胞發(fā)育與功能的調(diào)控及機(jī)制:1)foxo1缺陷導(dǎo)致cd62l低表達(dá)而損傷nk細(xì)胞向外周淋巴節(jié)的歸巢;2)foxo1負(fù)向調(diào)控nk細(xì)胞終末成熟而對(duì)nk細(xì)胞的早期成熟無(wú)明顯影響;3)foxo1抑制nk細(xì)胞的ifn-γ分泌功能和腫瘤細(xì)胞靶向殺傷作用;4)foxo1磷酸化介導(dǎo)了促炎因子或腫瘤細(xì)胞激活nk細(xì)胞過(guò)程中的foxo1轉(zhuǎn)錄活性失活,從而釋放foxo1對(duì)nk細(xì)胞發(fā)育與功能的抑制效應(yīng);5)通過(guò)構(gòu)建foxo1敲除、tbx21半敲除或者全敲的動(dòng)物模型,證實(shí)foxo1對(duì)nk細(xì)胞的成熟的抑制作用必需通過(guò)其對(duì)tbx21的抑制性調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn);6)在人nk細(xì)胞中foxo1直接結(jié)合tbx21dna啟動(dòng)子區(qū)域forkhead共有序列而在小鼠nk細(xì)胞中foxo1被sp1招募到小鼠tbx21啟動(dòng)子sp1的dna結(jié)合位點(diǎn)而抑制sp1對(duì)tbx21的轉(zhuǎn)錄起始作用。2.天然化合物pl-c通過(guò)tlr-nf-κb通路選擇性促進(jìn)人nk細(xì)胞ifn-γ分泌1)pl-c促進(jìn)人cd56bright和cd56dimnk細(xì)胞ifn-γ轉(zhuǎn)錄和分泌且與il-12具有協(xié)同效應(yīng),但不影響nk細(xì)胞殺傷及t細(xì)胞的ifn-γ分泌功能;2)pl-c對(duì)il-12和il-15的受體及其下游信號(hào)通路無(wú)明顯作用;3)pl-c通過(guò)直接激活tlr-nf-κb信號(hào)通路而促進(jìn)nk細(xì)胞ifn-γ分泌�？傊�,通過(guò)上述兩部分實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)了首個(gè)負(fù)性調(diào)控nk細(xì)胞終末成熟和功能的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子foxo1,且證實(shí)了其機(jī)制主要是通過(guò)且必需通過(guò)其對(duì)nk關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子tbx21表達(dá)的抑制性調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn),極大的豐富了nk細(xì)胞發(fā)育與功能的負(fù)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò);另一方面我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特異性激活nk細(xì)胞inf-γ分泌功能而不影響nk細(xì)胞殺傷功能的天然小分子化合物PL-C,且闡明了其機(jī)制是通過(guò)其對(duì)TLR-NF-κB軸的激動(dòng)作用而實(shí)現(xiàn)的,為基于INF-γ的臨床治療策略提供了一個(gè)新的可供探索的途徑。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：R392
【文章目錄】：
縮略語(yǔ)表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
    1.1 研究意義
    1.2 研究背景
    1.3 本文擬開(kāi)展的研究工作
第二章 Foxo1負(fù)性調(diào)控NK細(xì)胞的發(fā)育與成熟
    2.1 材料與方法
    2.2 結(jié)果
    2.3 討論
第三章 天然化合物Phyllanthusmin C通過(guò)TLR激活NF-kB增強(qiáng)人NK細(xì)胞IFN-g生成
    3.1 材料與方法
    3.2 結(jié)果
    3.3 討論
全文結(jié)論
本研究的創(chuàng)新之處
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述 記憶性NK細(xì)胞
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文
致謝

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本文編號(hào)：2855190