NK細胞是機體天然免疫的關鍵組分,占外周淋巴細胞的5~10%。它是機體免疫防御的第一道防線,在早期惡性轉化的細胞、病毒和胞內寄生菌、真菌的清除以及母胎界面的形成中具有關鍵作用。NK細胞的這些作用既可通過直接的細胞毒殺傷作用,也可通過其分泌的細胞因子如IFN-γ等參與調控適應性免疫而實現。小鼠NK細胞的發(fā)育主要源自于骨髓的造血干細胞,經共同淋巴祖細胞向NK祖細胞分化(precursor NK,pNK,CD122+NK1.1-DX5-)。p NK通過不成熟NK細胞(immature NK,i NK,CD122+NK1.1+DX5-)向成熟NK細胞(mature NK,mNK,CD122+NK1.1+DX5+)發(fā)育。當小鼠NK細胞獲得表面標志NK1.1分子后,根據表面受體CD11b和CD27的表達水平,依次由CD11b-CD27+向CD11b+CD27+而最終形成CD11b+CD27-終末成熟NK細胞。NK細胞發(fā)育與功能的正常發(fā)揮依賴于內源性、外源性因子;正向、負向轉錄因子的相互平衡。外源性因子主要包括正向的介素-15(IL-15)和負向的轉化生長因子-β(TGF-β),而內源性的轉錄因子主要包括調控NK細胞早期發(fā)育、促進pNK形成的Ikaros,Pu.1,Ets1和維生素D3調節(jié)蛋白1(VDUP-1);促進i NK形成的E4BP4,Id2和MEF;促進NK細胞終末成熟的GATA3、Tbx21、Eomes和Irf2。但是目前這些發(fā)現的轉錄因子均為正向調控NK細胞發(fā)育與成熟,而對NK細胞的內源性負性調控因子的認識仍處于初始階段。作為調控NK細胞終末成熟關鍵的轉錄因子,Tbx21基因敲除小鼠(Tbx21-/-)終末期CD11b+CD27-NK細胞亞群幾乎缺失,但其上游信號通路目前知之甚少。NK細胞是細胞因子IFN-γ的主要細胞來源,而IFN-γ在機體抵抗病毒入侵和腫瘤發(fā)生中具有重要作用。NK細胞IFN-γ分泌缺陷與腫瘤、感染易感性呈正相關。利用IL-2、IL-12等細胞因子刺激NK細胞或人重組IFN-γ增加體內IFN-γ水平進行臨床腫瘤治療的探索,雖有一定的治療效果,但由于其嚴重的毒副作用而令人失望。因此尋找新的化合物激活NK細胞產生IFN-γ而降低其體內毒性具有非常重要的臨床意義。基于上述我們提到的NK細胞發(fā)育與功能調控研究領域中的兩個關鍵問題,我們從內源性因子-轉錄因子foxo1和外源性因素-天然化合物phyllanthusminc(pl-c)兩個方面,深入探討nk細胞發(fā)育與功能的調控新機制,并尋找激活nk細胞ifn-γ分泌的新策略、新分子。方法與結果:1.foxo1對nk細胞發(fā)育與功能的調控作用及相關機制研究foxo1在細胞代謝、細胞周期、凋亡、自噬和抗氧化應激等方面具有重要作用。近期研究發(fā)現foxo1參與造血干細胞、共同淋巴祖細胞的生成,以及t、b細胞的發(fā)育與功能的調控,且在不同細胞中對靶基因的調控作用具有高度的細胞背景特異性。但是其在nk細胞中的作用目前尚未見研究報道。我們通過一系列的體內、外模型研究發(fā)現:(1)foxo1缺陷減少了nk細胞向外周淋巴節(jié)的歸巢,其機制可能與cd62l低表達有關為了研究foxo1對nk細胞發(fā)育與功能的影響,我們首先通過ncr1icre小鼠與foxo1fl/fl小鼠(含有floxedfoxo1等位基因)雜交構建了nk細胞foxo1特異性敲除(foxo1?nk)的小鼠模型。foxo1敲除后對骨髓、脾臟中nk細胞的比例、數量無明顯影響,但是顯著降低外周淋巴結nk細胞的比例和數量,且顯著降低淋巴細胞歸巢關鍵因子cd62l的表達。(2)foxo1以干細胞內源性的方式抑制nk細胞終末成熟foxo1?nk小鼠骨髓、脾臟、外周淋巴結和外周血終末成熟cd11b+cd27-nk細胞比例明顯增加,cd27表達降低,且終末成熟cd43+klrg+nk細胞比例增加。通過骨髓移植將野生型小鼠或foxo1?nk小鼠骨髓細胞移植至cd45.1同背景野生型小鼠中我們發(fā)現foxo1抑制了nk細胞成熟的動力學過程。而通過將野生型小鼠和foxo1?nk小鼠骨髓細胞以等比例的方式移植至同一rag2-/-il2rg-/-小鼠體內構建嵌合體小鼠發(fā)現foxo1以干細胞內源性的方式調節(jié)nk細胞的成熟。(3)foxo1抑制nk細胞ifn-γ分泌和腫瘤直接靶向殺傷作用foxo1?nk小鼠脾臟細胞在體外被il-12與il-18聯合刺激后分泌ifn-γ的nk細胞比例無明顯改變,但單個nk細胞分泌ifn-γ強度明顯增加;人nk細胞株nkl無論是持續(xù)過表達、可誘導性表達或敲低foxo1均以相同的方式影響ifn-γ的生成。foxo1敲除顯著升高小鼠nk細胞對yac-1的體外直接靶向殺傷作用,而過表達foxo1顯著抑制nkl細胞對靶細胞k562的直接靶向殺傷作用。體內實驗進一步證實foxo1敲除明顯抑制了小鼠b16f10細胞在體內向肺臟轉移的現象。(4)促炎因子或腫瘤刺激促進nk細胞foxo1的磷酸化而使其失活foxo1磷酸化后從細胞核向胞漿轉移而失去其轉錄活性。nk細胞發(fā)育與功能的關鍵細胞因子il-2、il-12和il-15迅速誘導人nk92細胞和小鼠nk細胞foxo1磷酸化。同時發(fā)現小鼠b16f10黑色素瘤細胞體內接種1周后肺臟nk細胞foxo1磷酸化水平明顯增高。(5)機制研究上發(fā)現foxo1直接結合人tbx21dna啟動子區(qū)域而通過與sp1的蛋白相互作用間接結合到小鼠tbx21dna啟動子sp1的結合位點而抑制sp1對tbx21表達的促進作用。我們發(fā)現foxo1mrna和蛋白表達隨著小鼠nk細胞的成熟依次降低而tbx21的表達方式與其恰恰相反。foxo1敲除后小鼠nk細胞tbx21mrna和蛋白表達顯著增高,而nkl細胞過表達或敲低foxo1均可負向調節(jié)tbx21的表達。通過chip實驗發(fā)現在人nk細胞中foxo1可直接結合到tbx21啟動子區(qū)域forkhead共有序列上,而通過ip和chip實驗發(fā)現小鼠nk細胞中foxo1只能以間接的方式被轉錄因子sp1招募至tbx21近端啟動子sp1的dna結合區(qū)域而實現對tbx21表達的抑制作用。(6)通過遺傳學方式證實foxo1對nk細胞成熟的抑制作用必需通過其對tbx21表達的抑制性調節(jié)為了進一步研究foxo1對nk細胞成熟的抑制作用與tbx21的關系,我們通過遺傳學手段將foxo1?nk小鼠與tbx21-/-雜交,獲得tbx21-/-和tbx21+/-foxo1缺陷小鼠,即tbx21-/-foxo1?nk(tbx21敲除純合子,無tbx21表達)和tbx21+/-foxo1?nk(tbx21敲除雜合子,tbx21低表達)。通過對上述小鼠nk細胞成熟狀態(tài)的分析我們發(fā)現在有tbx21存在的情況下(無論是野生型還是tbx21雜合子小鼠),foxo1敲除(tbx21+/-foxo1?nk小鼠)可促進nk細胞終末成熟,但當tbx21缺失的情況下(即tbx21純合子小鼠,無tbx21表達),foxo1敲除(tbx21-/-foxo1?nk小鼠)對nk細胞的成熟則無明顯影響。這說明foxo1抑制nk細胞成熟必需通過抑制tbx21的表達。2.天然化合物pl-c促進人nk細胞ifn-γ分泌及相關機制研究為了尋找更多的nk細胞激活途徑,改善目前臨床上提高體內ifn-γ水平的治療策略的毒副作用,本論文通過對近50多種天然化合物單體進行篩選,我們發(fā)現了一個源自木酚素植物提取物的小分子化合物phyllanthusminc(pl-c)可顯著增加人nk細胞ifn-γ的分泌。(1)pl-c促進人cd56bright和cd56dimnk細胞ifn-γ轉錄和分泌在細胞因子il-12、il-15存在或不存在的情況下,pl-c均可增加健康人外周血外周單個核細胞(pmbc)、富集nk細胞中ifn-γ+nk細胞比例;通過純化的nk細胞(≥99.5%)進一步分析發(fā)現,在il-12、il-15存在或不存在的情況下pl-c均可直接促進cd56bright和cd56dimnk細胞ifn-γmrna合成和蛋白分泌,且與il-12具有協同效應。(2)pl-c對人nk細胞直接靶向殺傷作用及t細胞ifn-γ分泌均無明顯影響為進一步研究pl-c對nk細胞殺傷功能的影響,我們采用純化nk細胞進行體外靶細胞直接殺傷實驗分析。我們發(fā)現nk細胞在il-12或il-15存在的情況下,pl-c對nk細胞高毒性的靶細胞k562或低毒性作用的多發(fā)性骨髓瘤細胞株arh-77的直接細胞殺傷作用均無明顯影響。為了分析pl-c對人nk細胞ifn-γ分泌是否具有細胞特異性,我們接下來觀察了在il-12或il-15存在的條件下,pl-c對cd4+和cd8+t細胞的ifn-γ分泌是否有促進作用。結果發(fā)現pl-c對cd4+和cd8+tifn-γ+細胞比例無顯著影響。(3)pl-c通過nf-κb信號通路促進nk細胞ifn-γ分泌為進一步研究pl-c促進nk細胞ifn-γ分泌的機制,我們綜合分析了既往報道的參與nk細胞ifn-γ分泌的主要信號通路。我們發(fā)現在il-12或il-15存在的情況下,pl-c對il-12、il-15的受體(il-12rβ1、il-12rβ2、il-15rα、il-15rβ)及其下游信號通路t-bet、stat家族等蛋白均無顯著影響。而不論il-12、il-15是否存在,pl-c均可顯著促進nf-κbp65的磷酸化,而對p65mrna和總蛋白的表達無明顯影響。且nf-κb特異性抑制劑甲苯磺�；�-l-苯丙氨酸氯甲基酮(tpck)可顯著抑制pl-c對人原代nk和細胞株nkl細胞ifn-γ分泌的促進作用。通過凝膠電泳遷移率實驗(emsa)和染色質免疫共沉淀(chip)實驗進一步分析發(fā)現pl-c可顯著促進p65結合到ifngdna啟動子c3-33pκb位點上。(4)tlr-nf-κb信號軸介導pl-c對nk細胞ifn-γ分泌的促進作用在免疫細胞接受外界因子刺激后tlr-nf-κb信號軸對大量細胞因子的產生具有重要作用,而nk細胞中表達較高水平的tlr1、tlr3和tlr6。為進一步分析toll樣受體(tlr)在pl-c促進nk細胞ifn-γ分泌中的作用,我們采用了抑制性抗體阻滯tlr信號、tlr激動劑、雙熒光素酶報告基因系統和tlr1shrna等方法證實了tlr介導的nf-κb激活。通過使用tlr1、tlr3或tlr6抗體來阻斷tlrs信號,我們發(fā)現tlr1、tlr6抗體可顯著抑制pl-c對nk細胞ifn-γ分泌的促進作用和p65磷酸化。pl-c還可促進tlr1/2和tlr6激動劑對nk細胞ifn-γ分泌的激動作用。在hek293t細胞中構建同時過表達tlr1或tlr6、pgl-3κb-luc報告質粒系統,我們發(fā)現pl-c可直接通過tlr1或tlr6增加nf-κb對κb位點的結合,且有一定的劑量依賴趨勢。通過shrna敲低nkl細胞中tlr1的表達可抑制pl-c對ifn-γ分泌的促進作用,這一發(fā)現進一步明確了pl-c激活tlr-nf-κb信號軸在促進nk細胞ifn-γ分泌中的作用。研究結論:1.foxo1對nk細胞發(fā)育與功能的調控及機制:1)foxo1缺陷導致cd62l低表達而損傷nk細胞向外周淋巴節(jié)的歸巢;2)foxo1負向調控nk細胞終末成熟而對nk細胞的早期成熟無明顯影響;3)foxo1抑制nk細胞的ifn-γ分泌功能和腫瘤細胞靶向殺傷作用;4)foxo1磷酸化介導了促炎因子或腫瘤細胞激活nk細胞過程中的foxo1轉錄活性失活,從而釋放foxo1對nk細胞發(fā)育與功能的抑制效應;5)通過構建foxo1敲除、tbx21半敲除或者全敲的動物模型,證實foxo1對nk細胞的成熟的抑制作用必需通過其對tbx21的抑制性調節(jié)而實現;6)在人nk細胞中foxo1直接結合tbx21dna啟動子區(qū)域forkhead共有序列而在小鼠nk細胞中foxo1被sp1招募到小鼠tbx21啟動子sp1的dna結合位點而抑制sp1對tbx21的轉錄起始作用。2.天然化合物pl-c通過tlr-nf-κb通路選擇性促進人nk細胞ifn-γ分泌1)pl-c促進人cd56bright和cd56dimnk細胞ifn-γ轉錄和分泌且與il-12具有協同效應,但不影響nk細胞殺傷及t細胞的ifn-γ分泌功能;2)pl-c對il-12和il-15的受體及其下游信號通路無明顯作用;3)pl-c通過直接激活tlr-nf-κb信號通路而促進nk細胞ifn-γ分泌�？傊�,通過上述兩部分實驗,我們發(fā)現了首個負性調控nk細胞終末成熟和功能的內源性轉錄因子foxo1,且證實了其機制主要是通過且必需通過其對nk關鍵轉錄因子tbx21表達的抑制性調節(jié)而實現,極大的豐富了nk細胞發(fā)育與功能的負性調控網絡;另一方面我們發(fā)現了一個特異性激活nk細胞inf-γ分泌功能而不影響nk細胞殺傷功能的天然小分子化合物PL-C,且闡明了其機制是通過其對TLR-NF-κB軸的激動作用而實現的,為基于INF-γ的臨床治療策略提供了一個新的可供探索的途徑。
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
縮略語表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
    1.1 研究意義
    1.2 研究背景
    1.3 本文擬開展的研究工作
第二章 Foxo1負性調控NK細胞的發(fā)育與成熟
    2.1 材料與方法
    2.2 結果
    2.3 討論
第三章 天然化合物Phyllanthusmin C通過TLR激活NF-kB增強人NK細胞IFN-g生成
    3.1 材料與方法
    3.2 結果
    3.3 討論
全文結論
本研究的創(chuàng)新之處
參考文獻
文獻綜述 記憶性NK細胞
    參考文獻
攻讀學位期間發(fā)表的論文
致謝

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本文編號：2855190