背景尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,近些年以來其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升的趨勢,目前其發(fā)病機理尚未明確。端粒長度和端粒酶活性的調(diào)節(jié)在人類衰老及腫瘤等疾病發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。端粒存在于真核生物染色體末端,是由8-20kb串聯(lián)重復的DNA (TTAGGG)序列及其相關蛋白質(zhì)所組成。端粒可以提供非轉錄DNA的緩沖物且在保護染色體末端免于融合和降解、染色體定位、復制、保護和調(diào)控細胞生長及壽命方面具有重要作用。端粒酶是一種由蛋白質(zhì)和RNA構成的核糖核蛋白體,為RNA依賴的DNA聚合酶,能將端粒片段加至端粒末端。作為端粒酶維持結構與功能的必需元件--端粒酶結合蛋白發(fā)揮著重要作用,而其中最重要的是端粒酶蛋白復合體,它可以調(diào)控3’的尾及t-環(huán)形成,是由TRF1(TTAGGG-重復序列結合因子1),TRF2, TIN2, RAP2, TPP1及POT1構成。端粒酶功能主要由端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)和端粒酶RNA組分通過在染色體末端合成端粒重復序列完成。TERT基因位于染色體5P15.33,正常體細胞攜帶2倍復制的TERT基因,如基因復制減少或增加都會出現(xiàn)異常。TERT復制增加會導致腫瘤的發(fā)生。超過30%的人類惡性腫瘤攜帶超過3倍的TERT基因復制。TERT啟動子富含GC,缺少TATA盒及CAAT盒,其至少包含5個SP1結合位點,2個E-boxes以及1個轉錄起始位點,可以結合多功能轉錄因子TFII-I,研究表明TERT轉錄機制受控于多個轉錄因子,如c-Myc, SP1, Survivin, STAT3, EWS-ETS, HIF-la, Mad/Max, P53, WT1, Rb, TGF-β/Smad, API等。TERT啟動子點突變在激活端粒酶的過程中起著重要作用。近期研究證明表遺傳學在尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,其中包括組蛋白修飾酶介導的PI3K-AKT信號通路作用,SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)是新近發(fā)現(xiàn)的組蛋白甲基化酶,其可以識別并結合下游靶基因啟動子的特異性序列(CCCTCC),從而引起組蛋白H3-K4雙甲基化／三甲基化,進而導致靶基因轉錄功能的改變。盡管SMYD3在人體正常組織中表達較弱或呈不表達狀態(tài),然而其在結腸癌、肝癌和乳腺癌等許多腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中呈現(xiàn)過表達狀態(tài),并在腫瘤發(fā)生及進展過程中起到至關重要的作用。在本研究中我們將探討TERT啟動子突變及SMYD3在尿路上皮癌中的情況及其臨床意義。目的本研究將檢測TERT啟動子在尿路上皮癌中突變情況和組蛋白甲基化酶SMYD3在下尿路膀胱尿路上皮癌(BC)中的表達情況及其與尿路上皮癌患者臨床病理間的相關關系,并通過體外細胞實驗,對SMYD3在膀胱癌中的生物學功能和作用機制進行初步的研究。方法采用Sanger測序法檢測98例腎盂癌,122例輸尿管癌,182例膀胱尿路上皮癌腫瘤組織,癌旁正常組織及與以上標本對應的20例輸尿管癌患者手術前尿液,16例腎盂癌患者術前尿液,102例膀胱癌患者術前尿液,46例術后尿液標本TERT啟動子的突變情況并分析TERT啟動子突變與腎盂癌,輸尿管癌,膀胱癌的臨床病理關系；采用castPCR法對以上患者尿液標本進行TERT啟動子突變‘的檢測,分析其與Sanger法在檢測敏感性和特異性上的差異性；在膀胱癌標本中檢測FGFR3-7/0/15的突變情況,并分析其與患者臨床病理關系及TERT啟動子突變間的相關性。運用實時熒光定量PCR (Realtime-PCR)檢測25例膀胱癌組織及其癌旁膀胱粘膜組織中SMYD3的表達情況,通過蛋白印跡實驗檢測膀胱尿路上皮癌中SMYD3的表達情況,使用卡方檢驗分析SMYD3免疫組化染色結果與膀胱癌患者的臨床病理關系,然后,我們選用膀胱尿路上皮癌典型細胞系T24和5637進行體外細胞實驗研究,運用特異性shRNA或siRNA轉染細胞,將T24和5637細胞的SMYD3的表達進行干擾,在干擾72小時內(nèi),我們使用RT-PCR及Western-Blot檢測SMYD3,PI3K-AKT通路及其他腫瘤相關基因在膀胱尿路上皮癌細胞系中的表達情況。運用克隆形成實驗(Colony formation assay)檢測了SMYD3與膀胱尿路上皮癌間的增殖關系；運用Transwell細胞遷移(Cell migration assay),侵襲實驗(Matrigel invation asssay)檢測SMYD3與膀胱尿路上皮癌間的遷移及侵襲關系,運用流式細胞儀檢測抑制SMYD3基因后,膀胱尿路上皮癌細胞凋亡及周期變化情況,采用穩(wěn)定轉染技術轉染SMYD3后,應用裸鼠體內(nèi)細胞成瘤實驗檢測抑制SMYD3后,膀胱尿路上皮癌細胞在裸鼠體內(nèi)增殖情況。結果我們通過Sanger法對220例上尿路尿路上皮癌的腫瘤組織進行TERT啟動子測序研究發(fā)現(xiàn),有43%腎盂癌(42/98)發(fā)生TERT啟動子突變—其中38例為C228T突變,4例為C250T突變；另外有19%輸尿管癌(23/122)發(fā)生TERT突變—其中15例C228T突變,7例C250T突變,其中遠處轉移組突變明顯高于未轉移組(P=0.013),在輸尿管癌中突變與年齡呈正相關(P=0.001),以上結果表明TERT啟動子突變與腫瘤的遠處轉移呈相關性,與患者的性別(P=0.646),臨床分期(P=0.216),病理分級(P=0.239),腫瘤大小(P=0.825)及周圍淋巴轉移(P=0.069)無相關性。TERT啟動子突變在上尿路尿路上皮癌中總的突變率為27%,突變與腫瘤的臨床病理未發(fā)現(xiàn)相關性；在36(其中10例組織發(fā)現(xiàn)TERT啟動子突變)例收集過尿液標本的上尿路腫瘤及70例下尿路膀胱腫瘤患者中,我們通過分別用Sanger法及castPCR法檢測標本TERT啟動子突變情況,通過分析我們發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢出結果顯示檢出率分別為50%和89%。另外我們用Sanger法對182例中國漢族患者和其中102例腫瘤尿液分析發(fā)現(xiàn),TERT啟動子和FGFR3突變分別為87/182(47.8%)和7/102(6.7%)；TERT啟動子突變患者的46的尿液中,檢測到TERT啟動子突變的有24(52%)例,這些突變患者在手術后一周尿液樣本檢測發(fā)現(xiàn)大部分(80%)TERT啟動子突變消失；在尿液中檢測TERT mRNA表達情況,我們發(fā)現(xiàn)46/49(94%)的標本中檢測到TERT表達。通過對SMYD3的研究我們發(fā)現(xiàn),實時熒光定量PCR實驗結果顯示:SMYD3在膀胱癌組織中的表達(0.152±0.031)較之癌旁組織(0.00039±0.0015)明顯升高(P=0.0426)。65例膀胱癌切片標本中,經(jīng)免疫組織化學實驗檢測顯示,8例(12%)細胞核SMYD3強染色,58例(89%)細胞質(zhì)染色,癌旁正常組織中僅個別樣本表現(xiàn)為細胞質(zhì)局部區(qū)域的弱染色(P0.01)。免疫染色強度與膀胱癌患者的病理分級(P0.01),臨床分期(P0.01),淋巴轉移(P=0.036)密切相關,與患者的性別(P=0.494),年齡(P=1.00)不相關。體外細胞實驗結果顯示,運用特異性shRNA或者siRNA轉染細胞,對T24及5637細胞的SMYD3的表達進行干擾,在干擾72小時內(nèi),我們采用Western-Blot法檢測,siRNA和shRNA干擾SMYD3后其在兩種細胞系中的表達明顯受到抑制；CCK-8實驗結果顯示SMYD3被抑制后細胞生長率也隨之受到明顯抑制,克隆形成實驗結果顯示,抑制SMYD3后兩種細胞的單克隆數(shù)量明顯低于對照組；裸鼠體外成瘤實驗結果顯示,穩(wěn)定轉染兩種細胞系后裸鼠皮下瘤細胞種植,8周后顯示兩個細胞系實驗組腫瘤大小明顯小于對照組(P=0.017,P=0.019)。流式細胞分析實驗結果顯示,抑制SMYD3表達后,兩種細胞系的凋亡較對照組明顯升高,細胞周期較之對照組明顯受到抑制；使用Western-Blot檢測shRNA抑制SMYD3后相關蛋白表達情況,結果顯示與對照組相比,實驗組促細胞凋亡蛋白P53, Bax及Bad表達明顯上調(diào),抑制凋亡相關蛋白Bcl-2明顯下調(diào),細胞周期相關蛋白cyclinD1,CDK4, cyclinEl, CDK2的表達受到明顯下調(diào),p21,p27的表達明顯上調(diào)。細胞Transwell遷移及侵襲實驗結果顯示與對照組相比,實驗組兩種細胞系的遷移能力均有明顯的受抑。使用Western-Blot檢測shRNA抑制SMYD3后結果顯示與對照組相比,實驗組SMYD3靶分子PI3K-AKT通路相關蛋白P-PI3K, P-AKT的表達明顯下調(diào)。結論綜上所述,在尿路上皮癌的組織及尿液中存在TERT啟動子突變現(xiàn)象,并且其在上尿路腎盂尿路上皮癌及下尿路的膀胱尿路上皮癌的突變率要明顯高于輸尿管尿路上皮癌；在上尿路上皮癌中TERT啟動子突變與腫瘤的遠處轉移呈正相關；TERT啟動子突變或許可以成為檢測腎盂癌及膀胱癌復發(fā)的一個診斷標志,而在中國漢族人群中FGFR3突變發(fā)生率非常低,不能作為膀胱癌診斷標志。SMYD3在膀胱尿路上皮癌中表達水平上調(diào)；SMYD3基因沉默可以有效抑制膀胱尿路上皮癌細胞的生長；SMYD3可能通過調(diào)控細胞凋亡及周期相關蛋白影響膀胱尿路上皮癌的進展；SMYD3可能介導PI3K-AKT通路,從而有助于膀胱尿路上皮癌的侵襲轉移。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R737
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號說明
第一部分 TERT啟動子突變在尿路上皮癌中的研究
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    附圖
    參考文獻
第二部分 SMYD3在膀胱尿路上皮癌中的研究
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    附圖
    參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的論文
學位論文評閱及答辯情況表
英文論文

【相似文獻】

相關博士學位論文 前2條

1 王坤;TERT啟動子突變及SMYD3在尿路上皮癌中的研究[D];山東大學;2015年

2 劉曉莉;甲狀腺癌TERT啟動子突變的篩查與臨床相關性分析[D];吉林大學;2013年

本文編號：2851043