背景尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,近些年以來(lái)其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升的趨勢(shì),目前其發(fā)病機(jī)理尚未明確。端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性的調(diào)節(jié)在人類(lèi)衰老及腫瘤等疾病發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。端粒存在于真核生物染色體末端,是由8-20kb串聯(lián)重復(fù)的DNA (TTAGGG)序列及其相關(guān)蛋白質(zhì)所組成。端�？梢蕴峁┓寝D(zhuǎn)錄DNA的緩沖物且在保護(hù)染色體末端免于融合和降解、染色體定位、復(fù)制、保護(hù)和調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)及壽命方面具有重要作用。端粒酶是一種由蛋白質(zhì)和RNA構(gòu)成的核糖核蛋白體,為RNA依賴(lài)的DNA聚合酶,能將端粒片段加至端粒末端。作為端粒酶維持結(jié)構(gòu)與功能的必需元件--端粒酶結(jié)合蛋白發(fā)揮著重要作用,而其中最重要的是端粒酶蛋白復(fù)合體,它可以調(diào)控3’的尾及t-環(huán)形成,是由TRF1(TTAGGG-重復(fù)序列結(jié)合因子1),TRF2, TIN2, RAP2, TPP1及POT1構(gòu)成。端粒酶功能主要由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)和端粒酶RNA組分通過(guò)在染色體末端合成端粒重復(fù)序列完成。TERT基因位于染色體5P15.33,正常體細(xì)胞攜帶2倍復(fù)制的TERT基因,如基因復(fù)制減少或增加都會(huì)出現(xiàn)異常。TERT復(fù)制增加會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。超過(guò)30%的人類(lèi)惡性腫瘤攜帶超過(guò)3倍的TERT基因復(fù)制。TERT啟動(dòng)子富含GC,缺少TATA盒及CAAT盒,其至少包含5個(gè)SP1結(jié)合位點(diǎn),2個(gè)E-boxes以及1個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),可以結(jié)合多功能轉(zhuǎn)錄因子TFII-I,研究表明TERT轉(zhuǎn)錄機(jī)制受控于多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,如c-Myc, SP1, Survivin, STAT3, EWS-ETS, HIF-la, Mad/Max, P53, WT1, Rb, TGF-β/Smad, API等。TERT啟動(dòng)子點(diǎn)突變?cè)诩せ疃肆Ｃ傅倪^(guò)程中起著重要作用。近期研究證明表遺傳學(xué)在尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,其中包括組蛋白修飾酶介導(dǎo)的PI3K-AKT信號(hào)通路作用,SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)是新近發(fā)現(xiàn)的組蛋白甲基化酶,其可以識(shí)別并結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子的特異性序列(CCCTCC),從而引起組蛋白H3-K4雙甲基化／三甲基化,進(jìn)而導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄功能的改變。盡管SMYD3在人體正常組織中表達(dá)較弱或呈不表達(dá)狀態(tài),然而其在結(jié)腸癌、肝癌和乳腺癌等許多腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)狀態(tài),并在腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。在本研究中我們將探討TERT啟動(dòng)子突變及SMYD3在尿路上皮癌中的情況及其臨床意義。目的本研究將檢測(cè)TERT啟動(dòng)子在尿路上皮癌中突變情況和組蛋白甲基化酶SMYD3在下尿路膀胱尿路上皮癌(BC)中的表達(dá)情況及其與尿路上皮癌患者臨床病理間的相關(guān)關(guān)系,并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),對(duì)SMYD3在膀胱癌中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制進(jìn)行初步的研究。方法采用Sanger測(cè)序法檢測(cè)98例腎盂癌,122例輸尿管癌,182例膀胱尿路上皮癌腫瘤組織,癌旁正常組織及與以上標(biāo)本對(duì)應(yīng)的20例輸尿管癌患者手術(shù)前尿液,16例腎盂癌患者術(shù)前尿液,102例膀胱癌患者術(shù)前尿液,46例術(shù)后尿液標(biāo)本TERT啟動(dòng)子的突變情況并分析TERT啟動(dòng)子突變與腎盂癌,輸尿管癌,膀胱癌的臨床病理關(guān)系；采用castPCR法對(duì)以上患者尿液標(biāo)本進(jìn)行TERT啟動(dòng)子突變‘的檢測(cè),分析其與Sanger法在檢測(cè)敏感性和特異性上的差異性；在膀胱癌標(biāo)本中檢測(cè)FGFR3-7/0/15的突變情況,并分析其與患者臨床病理關(guān)系及TERT啟動(dòng)子突變間的相關(guān)性。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Realtime-PCR)檢測(cè)25例膀胱癌組織及其癌旁膀胱粘膜組織中SMYD3的表達(dá)情況,通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱尿路上皮癌中SMYD3的表達(dá)情況,使用卡方檢驗(yàn)分析SMYD3免疫組化染色結(jié)果與膀胱癌患者的臨床病理關(guān)系,然后,我們選用膀胱尿路上皮癌典型細(xì)胞系T24和5637進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究,運(yùn)用特異性shRNA或siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,將T24和5637細(xì)胞的SMYD3的表達(dá)進(jìn)行干擾,在干擾72小時(shí)內(nèi),我們使用RT-PCR及Western-Blot檢測(cè)SMYD3,PI3K-AKT通路及其他腫瘤相關(guān)基因在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。運(yùn)用克隆形成實(shí)驗(yàn)(Colony formation assay)檢測(cè)了SMYD3與膀胱尿路上皮癌間的增殖關(guān)系；運(yùn)用Transwell細(xì)胞遷移(Cell migration assay),侵襲實(shí)驗(yàn)(Matrigel invation asssay)檢測(cè)SMYD3與膀胱尿路上皮癌間的遷移及侵襲關(guān)系,運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抑制SMYD3基因后,膀胱尿路上皮癌細(xì)胞凋亡及周期變化情況,采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染SMYD3后,應(yīng)用裸鼠體內(nèi)細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制SMYD3后,膀胱尿路上皮癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖情況。結(jié)果我們通過(guò)Sanger法對(duì)220例上尿路尿路上皮癌的腫瘤組織進(jìn)行TERT啟動(dòng)子測(cè)序研究發(fā)現(xiàn),有43%腎盂癌(42/98)發(fā)生TERT啟動(dòng)子突變—其中38例為C228T突變,4例為C250T突變；另外有19%輸尿管癌(23/122)發(fā)生TERT突變—其中15例C228T突變,7例C250T突變,其中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組突變明顯高于未轉(zhuǎn)移組(P=0.013),在輸尿管癌中突變與年齡呈正相關(guān)(P=0.001),以上結(jié)果表明TERT啟動(dòng)子突變與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈相關(guān)性,與患者的性別(P=0.646),臨床分期(P=0.216),病理分級(jí)(P=0.239),腫瘤大小(P=0.825)及周?chē)馨娃D(zhuǎn)移(P=0.069)無(wú)相關(guān)性。TERT啟動(dòng)子突變?cè)谏夏蚵纺蚵飞掀ぐ┲锌偟耐蛔兟蕿?7%,突變與腫瘤的臨床病理未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性；在36(其中10例組織發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子突變)例收集過(guò)尿液標(biāo)本的上尿路腫瘤及70例下尿路膀胱腫瘤患者中,我們通過(guò)分別用Sanger法及castPCR法檢測(cè)標(biāo)本TERT啟動(dòng)子突變情況,通過(guò)分析我們發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢出結(jié)果顯示檢出率分別為50%和89%。另外我們用Sanger法對(duì)182例中國(guó)漢族患者和其中102例腫瘤尿液分析發(fā)現(xiàn),TERT啟動(dòng)子和FGFR3突變分別為87/182(47.8%)和7/102(6.7%)；TERT啟動(dòng)子突變患者的46的尿液中,檢測(cè)到TERT啟動(dòng)子突變的有24(52%)例,這些突變患者在手術(shù)后一周尿液樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大部分(80%)TERT啟動(dòng)子突變消失；在尿液中檢測(cè)TERT mRNA表達(dá)情況,我們發(fā)現(xiàn)46/49(94%)的標(biāo)本中檢測(cè)到TERT表達(dá)。通過(guò)對(duì)SMYD3的研究我們發(fā)現(xiàn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:SMYD3在膀胱癌組織中的表達(dá)(0.152±0.031)較之癌旁組織(0.00039±0.0015)明顯升高(P=0.0426)。65例膀胱癌切片標(biāo)本中,經(jīng)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示,8例(12%)細(xì)胞核SMYD3強(qiáng)染色,58例(89%)細(xì)胞質(zhì)染色,癌旁正常組織中僅個(gè)別樣本表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)局部區(qū)域的弱染色(P0.01)。免疫染色強(qiáng)度與膀胱癌患者的病理分級(jí)(P0.01),臨床分期(P0.01),淋巴轉(zhuǎn)移(P=0.036)密切相關(guān),與患者的性別(P=0.494),年齡(P=1.00)不相關(guān)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,運(yùn)用特異性shRNA或者siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,對(duì)T24及5637細(xì)胞的SMYD3的表達(dá)進(jìn)行干擾,在干擾72小時(shí)內(nèi),我們采用Western-Blot法檢測(cè),siRNA和shRNA干擾SMYD3后其在兩種細(xì)胞系中的表達(dá)明顯受到抑制；CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SMYD3被抑制后細(xì)胞生長(zhǎng)率也隨之受到明顯抑制,克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑制SMYD3后兩種細(xì)胞的單克隆數(shù)量明顯低于對(duì)照組；裸鼠體外成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞系后裸鼠皮下瘤細(xì)胞種植,8周后顯示兩個(gè)細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)組腫瘤大小明顯小于對(duì)照組(P=0.017,P=0.019)。流式細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑制SMYD3表達(dá)后,兩種細(xì)胞系的凋亡較對(duì)照組明顯升高,細(xì)胞周期較之對(duì)照組明顯受到抑制；使用Western-Blot檢測(cè)shRNA抑制SMYD3后相關(guān)蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組促細(xì)胞凋亡蛋白P53, Bax及Bad表達(dá)明顯上調(diào),抑制凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2明顯下調(diào),細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1,CDK4, cyclinEl, CDK2的表達(dá)受到明顯下調(diào),p21,p27的表達(dá)明顯上調(diào)。細(xì)胞Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組兩種細(xì)胞系的遷移能力均有明顯的受抑。使用Western-Blot檢測(cè)shRNA抑制SMYD3后結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組SMYD3靶分子PI3K-AKT通路相關(guān)蛋白P-PI3K, P-AKT的表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論綜上所述,在尿路上皮癌的組織及尿液中存在TERT啟動(dòng)子突變現(xiàn)象,并且其在上尿路腎盂尿路上皮癌及下尿路的膀胱尿路上皮癌的突變率要明顯高于輸尿管尿路上皮癌；在上尿路上皮癌中TERT啟動(dòng)子突變與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；TERT啟動(dòng)子突變或許可以成為檢測(cè)腎盂癌及膀胱癌復(fù)發(fā)的一個(gè)診斷標(biāo)志,而在中國(guó)漢族人群中FGFR3突變發(fā)生率非常低,不能作為膀胱癌診斷標(biāo)志。SMYD3在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)水平上調(diào)；SMYD3基因沉默可以有效抑制膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；SMYD3可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白影響膀胱尿路上皮癌的進(jìn)展；SMYD3可能介導(dǎo)PI3K-AKT通路,從而有助于膀胱尿路上皮癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：R737
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號(hào)說(shuō)明
第一部分 TERT啟動(dòng)子突變?cè)谀蚵飞掀ぐ┲械难芯?br>    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖
    參考文獻(xiàn)
第二部分 SMYD3在膀胱尿路上皮癌中的研究
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文
學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表
英文論文

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 王坤;TERT啟動(dòng)子突變及SMYD3在尿路上皮癌中的研究[D];山東大學(xué);2015年

2 劉曉莉;甲狀腺癌TERT啟動(dòng)子突變的篩查與臨床相關(guān)性分析[D];吉林大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2851043