發(fā)布時間：2020-09-29 18:06

　　 研究背景：骨肉瘤生長快增殖迅速,生長方式呈浸潤性生長破壞周圍正常組織。骨肉瘤惡性程度高而且進(jìn)展快,早期即易發(fā)生血道轉(zhuǎn)移且易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,復(fù)發(fā)率高,預(yù)后較差。目前尚無有效的治療手段將之完全治愈。因此,該疾病嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。對于骨肉瘤的研究,人們已經(jīng)在分子水平取得了長足的進(jìn)步,找到了一些骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因,其中就包括對與骨肉瘤相關(guān)的miRNA的研究。microRNA是19-25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA,它與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)通過堿基序列互補(bǔ)特異性結(jié)合,進(jìn)而抑制靶基因蛋白質(zhì)翻譯。現(xiàn)已在人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種miRNA,廣泛參與增殖、凋亡、發(fā)育、分化等過程的基因表達(dá)調(diào)控,并與包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前在骨肉瘤中已篩選出一些表達(dá)異常miRNA s。其中,在骨肉瘤中miR-34家族成員表達(dá)降低,而miR-34家族可通過一種p53依賴方式影響靶基因的表達(dá)。miR-34c通過抑制Notch信號途徑抑制成骨細(xì)胞分化,促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生。在骨肉瘤中miR-24過表達(dá),通過調(diào)節(jié)溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶β(lysophosphatidic acid acyltransferaseβ,LPAATβ)基因表達(dá)參與骨肉瘤發(fā)病。miR-16可以抑制絲裂原活化蛋白激酶激酶(Rafl-mitogen-activated protein kinase, MAPK)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)信號通路,沉默胰島素樣生長因子-1受體(Insulin like growth factor-1 receptor, IGF1R),抑制細(xì)胞生長。在骨肉瘤中,miR-16表達(dá)下調(diào)。miR-148a是miR-148/152家族成員之一,已有研究顯示,miR-148a在腫瘤細(xì)胞增殖和癌癥侵襲過程中起著重要的作用,并且在不同的腫瘤組織中表達(dá)具有特異性。有研究采用高通量的microRNA表達(dá)譜芯片的方法研究骨肉瘤組織中異常的microRNA表達(dá)譜,結(jié)果顯示,骨肉瘤組織中存在有數(shù)十個顯著表達(dá)差異的microRNA,其中包括niR-148a。本研究的前期實(shí)驗(yàn)也表明：miR-148a在骨肉瘤中的表達(dá)較癌旁非腫瘤骨組織的表達(dá)明顯上調(diào),并且在轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)明顯高于非轉(zhuǎn)移組。由此說明,miR-148a可能在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展特別是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用,但其可能的生物學(xué)功能和機(jī)制尚不完全明確。miRNAs不僅在實(shí)體腫瘤中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,而且可被釋放入血成為腫瘤特定的標(biāo)記物。在胃癌患者血清中,有許多miRNAs出現(xiàn)表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào),其中,miR-184表達(dá)水平最高,而對胃癌患者進(jìn)行手術(shù)治療后,miR-184表達(dá)水平即明顯下降。在前列腺癌患者外周血中,miR-141表達(dá)明顯升高,可用于篩查前列腺癌患者和正常對照組。而miR-148a是否在骨肉瘤患者的外周血中表達(dá)異常還尚不明了,其是否能夠成為外周血中的骨肉瘤標(biāo)記物值得探討。研究目的：本研究探討miR-148a與骨肉瘤的關(guān)系,揭示miR-148a在骨肉瘤中的表達(dá)與骨肉瘤臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,為深入了解miR-148a與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)；分析骨肉瘤患者外周血中miR-148a的表達(dá)與患者臨床病理資料之間的關(guān)系,為miR-148a作為骨肉瘤的外周血標(biāo)記物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；證實(shí)miR-148a在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能,明確miR-148a是否對骨肉瘤的轉(zhuǎn)移具有調(diào)節(jié)作用并篩選miR-148a調(diào)節(jié)的靶基因,為骨肉瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法：(一)在骨肉瘤組織中以RT-qPCR的方法檢測miR-148a的表達(dá)情況,分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。征求骨肉瘤患者同意,收集骨肉瘤及非腫瘤骨組織的手術(shù)后的石蠟標(biāo)本。經(jīng)病理診斷為骨肉瘤并且完好保存的標(biāo)本經(jīng)切片、脫蠟并準(zhǔn)確刮取骨肉瘤癌組織部分,加入提取試劑按照說明操作將組織中的miRNAs抽提。經(jīng)過分光光度儀測定RNA的濃度和純度以后保存待用。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄,經(jīng)RT-qPCR檢測miR-148a表達(dá)的情況。結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)分析miR-148a與臨床病理參數(shù)的之間的關(guān)系。相應(yīng)的臨床病理參數(shù)包括性別,年齡,腫瘤大小,腫瘤分期,組織學(xué)類型,腫瘤定位,轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)生存分析和單／多因素分析。(二)檢測骨肉瘤患者血清中miR-148a的表達(dá),分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。征求上述骨肉瘤患者同意,在收集骨肉瘤組織標(biāo)本的同時抽取患者外周血5ml,12000轉(zhuǎn)／分高速離心,將分離后分離的血清儲存于-80℃保存待用。抽取健康人志愿者外周血按上述方法處理保存,作為對照樣本。將血清中加入Trizol試劑,按照說明操作提取血清中RNA。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄,經(jīng)RT-qPCR檢測血清中miR-148a表達(dá)的情況。結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)分析miR-148a與臨床病理參數(shù)的之間的關(guān)系。相應(yīng)的臨床病理參數(shù)同骨肉瘤組織中分析miR-148a表達(dá)模式的參數(shù),揭示其在外周血中腫瘤標(biāo)記物的功能。p(三)在體外驗(yàn)證miR-148a對骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。將骨肉瘤細(xì)胞種植于12孔板中,貼壁后轉(zhuǎn)染miR-148a前體pre-miR-148a及對照片段Negative control;轉(zhuǎn)染后24、48及72小時候收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對miR-148a的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測。證實(shí)能夠成功過表達(dá)miR-148a后,將細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后24小時進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn),在體外細(xì)胞學(xué)水平證實(shí)miR-148a對骨肉瘤細(xì)胞遷移和浸潤能力的影響；同時進(jìn)行MTS實(shí)驗(yàn)在24,48和72小時檢測miR-148a對細(xì)胞增殖能力的影響。(四)驗(yàn)證miR-148a調(diào)控的直接靶基因。構(gòu)建SMAD2和CHD1的3’-UTR雙熒光素酶載體建。將骨肉瘤細(xì)胞種植與12孔板中,貼壁后分別共轉(zhuǎn)染pre-miR-148a+雙熒光素酶載體及pre-miR-NC+雙熒光素酶載體；48小時后收取細(xì)胞裂解液檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組雙熒光素酶表達(dá)差異,鑒別受miR-148a直接調(diào)控的靶基因。結(jié)果：(一)miR-148a在骨肉瘤組織中的表達(dá)及與臨床病理資料的關(guān)系。將收集的標(biāo)本經(jīng)過處理之后,RT-qPCR方法檢測niR-148a在106例骨肉瘤組織及89例非腫瘤組織中的表達(dá),在經(jīng)過統(tǒng)計(jì)軟件的對其與臨床病理參數(shù)經(jīng)行分析,結(jié)果顯示相對于非腫瘤骨組織miR-148a在腫瘤組織中呈現(xiàn)明顯高表達(dá),并且miR-148a在40例發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織樣本中的表達(dá)明顯高于56例非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織中的表達(dá)；miR-148a在≥20歲年齡組患者的骨肉瘤標(biāo)本中明顯高表達(dá)。而miR-148a在性別,腫瘤大小,腫瘤定位,組織學(xué)類型及對化療反應(yīng)的不同樣本中表達(dá)無明顯差異；相對于存活的患者,miR-148a在已經(jīng)死亡的患者中表達(dá)上調(diào),生存分析顯示miR-148a高表達(dá)的骨肉瘤患者具有更短的總體生存時間和腫瘤特異性生存時間；多因素分析顯示miR-148a的表達(dá)高低以及轉(zhuǎn)移與否是骨肉瘤患者總體生存和腫瘤特異性生存的獨(dú)立預(yù)后因素,腫瘤大小還在總體生存的單因素分析和多因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(二)miR-148a在骨肉瘤患者外周血中的表達(dá)及與臨床病理資料的關(guān)系。RT-qPCR檢測分析顯示miR-148a在骨肉瘤患者的外周血中的表達(dá)較健康人外周血中的表達(dá)明顯升高,miR-148a還在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的外周血中的表達(dá)進(jìn)一步升高。分析還發(fā)現(xiàn)相對于對化療反應(yīng)差的病例,miR-148a還在對化療反應(yīng)較好的患者外周血中的表達(dá)明顯上調(diào)。miR-148a在死亡組的患者外周血中的表達(dá)明顯增加,生存分析證實(shí)外周血中的miR-148a高表達(dá)患者同樣有著較差的總體生存和腫瘤特異性生存預(yù)后。外周血中miR-148a的表達(dá)高低是總體生存和腫瘤特異性生存的獨(dú)立預(yù)后因素。(三)miR-148a在骨肉瘤組織和對應(yīng)的外周血中的表達(dá)成正相關(guān)。將RT-qPCR檢測miR-148a在106例骨肉瘤組織中的表達(dá)和其在對應(yīng)的外周血中的表達(dá)做相關(guān)分析,結(jié)果揭示兩者的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。(四)miR-148a促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和浸潤能力。將miR-148a轉(zhuǎn)染進(jìn)入骨肉瘤細(xì)胞系U-2 OS,檢測發(fā)現(xiàn)該方法能夠成功實(shí)現(xiàn)對miR-148a的過表達(dá)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和浸潤實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)miR-148a的骨肉瘤細(xì)胞穿過小室的能力均明顯增加,說明miR-148a能夠明顯促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和浸潤能力。MTS實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-148a對骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力無明顯影響。(五)miR-148a直接調(diào)控靶基因SMAD2。軟件預(yù)測出miR-148a可能的靶基因SMAD2、CHD1、MED12L及ZNF217,經(jīng)過雙熒光素酶驗(yàn)證SMAD2受miR-148a的直接調(diào)控。結(jié)論：我們的研究證實(shí)了miR-148 a在骨肉瘤組織和患者外周血中的表達(dá)上調(diào),并均在轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)進(jìn)一步上升；高表達(dá)的miR-148a骨肉瘤患者有著較差的5年生存預(yù)后,同時在骨肉瘤與外周血中高表達(dá)的miR-148a和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是骨肉瘤患者的兩個獨(dú)立預(yù)后因素;miR-148a在骨肉瘤中的表達(dá)和其在患者外周血中的表達(dá)具有很好地相關(guān)性；因此,miR-148a可以在骨肉瘤患者外周血中成為良好的腫瘤標(biāo)記物和患者較好的預(yù)后指標(biāo)。miR-148a能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和浸潤能力,并且可能通過直接調(diào)節(jié)靶基因SMAD2發(fā)揮調(diào)節(jié)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的作用。這為骨肉瘤的治療提供了潛在的新治療靶點(diǎn),對與骨肉瘤患者具有重要的意義。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R738.1
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號說明
前言
實(shí)驗(yàn)材料與方法
結(jié)果
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
Paper 1
Paper 2
學(xué)位論文評巧及答辯情況表

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 徐鋼;龐健;熊焰;;普通型骨肉瘤腫瘤性骨樣組織形態(tài)學(xué)及免疫組化觀察[J];實(shí)用醫(yī)院臨床雜志;2008年01期

2 王敬瀚;;ROC曲線在臨床醫(yī)學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用[J];中華高血壓雜志;2008年02期

本文編號：2830075