發(fā)布時間：2020-09-28 20:40

　　 [背景]隨著生物醫(yī)學(xué)材料在臨床的廣泛應(yīng)用,以生物材料為中心的感染成為十分常見的醫(yī)院內(nèi)感染。尤其是長期氣管插管患者引發(fā)的生物材料植入相關(guān)混合微生物感染,具有難治性、反復(fù)性、耐藥性等特點,常常導(dǎo)致臨床感染遷延不愈,引發(fā)災(zāi)難性后果。研究表明,表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌是引發(fā)臨床生物材料植入感染的常見條件致病菌。目前,有關(guān)生物材料植入引發(fā)的混合生物膜感染研究報道甚少。本研究通過建立氣管導(dǎo)管材料表面混合生物膜體外模型,為生物材料植入引發(fā)的混合生物膜感染研究提供實驗?zāi)Ｐ停谎芯繗夤軐?dǎo)管材料表面混合微生物生物膜與單一微生物生物膜的差異,為生物材料植入相關(guān)混合微生物生物膜感染的防治研究提供新思路；探討真菌密度感應(yīng)分子法尼醇(Famesol)、對羥基苯乙醇(Tyrosol)對氣管導(dǎo)管材料表面表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合生物膜的作用,為臨床防治生物材料相關(guān)混合微生物感染提供幫助。第一部分：氣管導(dǎo)管材料表面細菌與真菌混合生物膜形成及相關(guān)基因研究[目的]建立氣管導(dǎo)管材料表面混合微生物生物膜體外模型；觀察氣管導(dǎo)管材料表面表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌形成的混合微生物生物膜與單一微生物生物膜在生長特性、體外生長動力學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及基因表達方面的差異。[方法]選用聚氯乙烯氣管導(dǎo)管作為實驗材料。實驗分組：表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC35984 (生物膜形成陽性)單獨培養(yǎng)組(表葡陽性組)、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC12228(生物膜形成陰性)單獨培養(yǎng)組(表葡陰性組)、白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231單獨培養(yǎng)組(白念組)、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC35984 (生物膜形成陽性)和白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231混合培養(yǎng)組(陽性混合組)、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC12228(生物膜形成陰性)和白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 10231混合培養(yǎng)組(陰性混合組)共5組。建立單一微生物、混合微生物在氣管導(dǎo)管材料表面體外生物膜模型,各組分別在培養(yǎng)2h、4h、6h、8h、 24h、48h、72h,用結(jié)晶紫染色法檢測生物膜形成能力；二甲氧唑黃(XTT)比色法評價生物膜的體外生長動力學(xué)；激光共聚焦顯微鏡觀察氣管導(dǎo)管材料表面生物膜生長狀態(tài)；分別于24h、72h掃描電子顯微鏡觀察氣管導(dǎo)管材料表面生物膜超微結(jié)構(gòu)；熒光定量PCR分析各組表皮葡萄球菌及白假絲酵母菌生物膜形成相關(guān)基因的表達差異。[結(jié)果]①.結(jié)晶紫染色法檢測生物膜形成能力結(jié)果：表葡陽性組和陽性混合組均在培養(yǎng)12h起生物膜開始增厚,至培養(yǎng)24h生物膜生長趨于平衡,隨培養(yǎng)時間延長生物膜生長再增厚,至培養(yǎng)72h陽性混合組超過表葡陽性組,組間比較除72h其余各時點兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；白念組12h出現(xiàn)生物膜生長,在所有時點白念組生物膜厚度均低于陽性混合組(P0.05)。表葡陰性組、陰性混合組在整個培養(yǎng)周期無生物膜形成。②.XTT比色法檢測生物膜生長動力學(xué)結(jié)果：陽性混合組48h前OD值低于表葡陽性組,48h、72h時點OD值高于表葡陽性組,組間比較12h時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；陽性混合組2h、4h時點OD值低于白念組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),6h后各時點OD值顯著高于白念組(P0.05)。陰性混合組2h、48h時點OD值高于表葡陰性組,其余各時點低于表葡陰性組,組間比較6h、8h時點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；陰性混合組2h、4h時點OD值低于白念組,其余各時點均高于白念組,組間比較除外2h、4h、72h時點,其余各時點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。③.激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果：死／活菌染色法陽性混合組生物膜24h基本為活菌,48h以活菌為主的活、死菌交織生長,72h生物膜死菌較前明顯增多；陰性混合組24h、48h基本為活菌,72h出現(xiàn)少量死菌。熒光原位雜交陽性混合組培養(yǎng)24h兩種微生物生長良好,有少量菌絲形成；培養(yǎng)72h兩種微生物較前生長的更為密集,有大量菌絲形成。陰性混合組24h表皮葡萄球菌散在生長,白假絲酵母菌在局部聚集成團狀；培養(yǎng)72h表皮葡萄球菌較前有所增多,白假絲酵母菌生長良好,局部有菌絲形成。④.掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果：培養(yǎng)24h與表葡陽性組表皮葡萄球菌形成的三維立體結(jié)構(gòu)或白念組白假絲酵母菌的孢子及菌絲形成的三維立體結(jié)構(gòu)相比較,陽性混合組表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混雜生長,在孢子及菌絲形成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中混有表皮葡萄球菌,初步形成具有三維空間立體構(gòu)象的混合生物膜。陰性混合組培養(yǎng)24h見白假絲酵母菌的孢子及菌絲生長,表皮葡萄球菌散在平鋪生長,未見明顯三維立體結(jié)構(gòu)的生物膜形成。⑤.熒光定量PCR結(jié)果：培養(yǎng)72h陽性混合組與表葡陽性組相比,icaA、aap、he基因表達均上調(diào),分別為1.52倍、1.46倍、1.93倍；與白念組相比als3、hwp1基因表達上調(diào),分別為4.22倍、2.56倍。培養(yǎng)72h陰性混合組與表葡陰性組相比,aap、fbe基因表達下調(diào),分別為0.25倍、0.47倍；與白念組相比als3基因表達上調(diào),為2.21倍；hwpl基因表達下調(diào),為0.57倍。[結(jié)論]1.生物膜形成陽性表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌培養(yǎng)24h能在氣管導(dǎo)管材料表面形成由表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混雜生長、結(jié)構(gòu)致密、高度組織化的多細胞群體結(jié)構(gòu)即成熟的混合生物膜。2.生物膜形成陽性表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合培養(yǎng),能形成較單一白假絲酵母菌更厚、結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的混合生物膜,這可能是導(dǎo)致臨床生物材料混合微生物感染遷延不愈重要原因之一；混合生物膜形成過程中,與表葡陽性組相比icaA、aap、fbe基因表達上調(diào),與白念組相比als3、hwpl基因表達上調(diào),可能與混合生物膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜相關(guān)。3.生物膜形成陰性表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合培養(yǎng),未較單一微生物形成更厚的生物膜；在培養(yǎng)過程中,aap、fbe、hwpl基因下調(diào),提示生物膜形成陰性表皮葡萄球菌不能促進與白假絲酵母菌混合生物膜的形成。第二部分：真菌密度感應(yīng)分子對氣管導(dǎo)管表面表皮葡萄球菌及白假絲酵母菌混合生物膜形成的影響及其可能機制[目的]探討真菌密度感應(yīng)分子Farnesol、Tyrosol對氣管導(dǎo)管材料表面表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合生物膜形成的影響及其可能機制。[方法]選用聚氯乙烯氣管導(dǎo)管作為實驗材料。將表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC35984(生物膜形成陽性)和白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231混合培養(yǎng),按照給予不同處理因素將實驗分為3組,加入真菌密度感應(yīng)分子Farnesol (DF組)、真菌密度感應(yīng)分子Tyrosol(DT組)、相同體積的去離子水(DD組),分別于培養(yǎng)2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h、96h,結(jié)晶紫染色法檢測生物膜形成能力；二甲氧唑黃(XTT)比色法評價生物膜的體外生長動力學(xué)；激光共聚焦顯微鏡觀察各組生物膜生長狀況；掃描電子顯微鏡觀察各組生物膜超微結(jié)構(gòu)；熒光定量PCR分析各組表皮葡萄球菌及白假絲酵母菌生物膜形成相關(guān)基因icaA、ap、fbe、 als3、hwp1、efg1等的表達情況。[結(jié)果]①.結(jié)晶紫染色法檢測生物膜形成能力結(jié)果：生物膜形成能力檢測組間整體比較,在整個培養(yǎng)周期2h-96h,DF組、DT組及DD組三個組整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。DD組分別與DF組、DT組比較,生物膜形成能力差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2h-96h整個培養(yǎng)周期內(nèi),除4h和72h兩個時點,DF組生物膜厚度均小于DD組,組間比較顯示12h、24h差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在2h-96h整個培養(yǎng)周期內(nèi),除外12h時點,DT組生物膜厚度均大于DD組,組間比較2h、4h、6h差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。②.XTT比色法檢測生長動力學(xué)結(jié)果：生物膜體外生長動力學(xué)組間總體比較,在整個培養(yǎng)周期2h-96h,DF組、DT組及DD組三個組整體差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2h-96h整個培養(yǎng)周期內(nèi),除外72h DF組的生長動力學(xué)均小于或等于DD組,組間比較顯示4h、48h這兩個時間點,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在2h-96h整個培養(yǎng)周期內(nèi),4h、12h、72h DT組的生長動力學(xué)均大于或等于DD組,組間比較12h差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。③.激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果：死／活菌染色法三組生物膜中兩種微生物混雜生長,24h基本為活菌,48h為以活菌為主的活、死菌交織生長,72h死菌較48h明顯增多。④.掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果：DD組培養(yǎng)24h表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌的孢子、菌絲混雜生長,初步形成具有三維立體結(jié)構(gòu)的混合生物膜；72h表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌的孢子、菌絲生長更加密集,混合生物膜結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。DF組培養(yǎng)24h表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌的孢子混雜生長,未見明顯菌絲形成；72h視野內(nèi)表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌的孢子、少量菌絲混雜生長。DT組培養(yǎng)24h表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌的孢子菌絲混雜生長,初步形成具有立體三維結(jié)構(gòu)的混合生物膜,表皮葡萄球菌呈團塊狀、蘑菇樣密集生長將孢子及菌絲幾乎完全包裹；72h視野內(nèi)大量表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌的孢子及菌絲混雜生長,表皮葡萄球菌黏附在孢子及菌絲表面,將其包裹形成復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)的混合生物膜。⑤.熒光定量PCR結(jié)果：與DD組相比,DF組培養(yǎng)6h icaA、aap、fbe基因下調(diào),分別為0.83倍、0.59倍、0.75倍；培養(yǎng)24haap基因下調(diào),為0.67倍,icaA、fbe基因上調(diào),分別為2.36倍、1.99倍。與DD組相比,DF組培養(yǎng)6h als3、hwp1、eef1基因下調(diào),分別為0.41倍、0.43倍、0.27倍；培養(yǎng)24h als3、hwp1、efg1基因下調(diào),分別為0.14倍、0.06倍、0.79倍。與DD組相比,DT組培養(yǎng)6h和24h icaA、aap、fbe基因上調(diào),分別為1.61倍、1.05倍、1.86倍和25.59倍、17.65倍、21.46倍；培養(yǎng)6h和培養(yǎng)24hDT組als3、hwp1、eef1基因下調(diào),分別為0.27倍、0.26倍、0.30倍和0.79倍、0.59倍、0.65倍。[結(jié)論]1.真菌密度感應(yīng)分子法尼醇在表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合生物膜形成過程中會產(chǎn)生一定的抑制作用,提示法尼醇或許能成為臨床混合微生物生物膜感染治療的方向；法尼醇能使混合生物膜形成能力下降,生長動力學(xué)降低,抑制生物膜結(jié)構(gòu)形成,通過作用于密度感應(yīng)系統(tǒng)達到影響生物膜形成的作用。法尼醇對icaA、fbe基因的早期下調(diào)及als3、hwp1、efg1、aap基因的持續(xù)下調(diào),可能是抑制混合生物膜形成機制之一。2。真菌密度感應(yīng)分子對羥基苯乙醇在表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合生物膜形成過程中會產(chǎn)生一定的促進作用,尋找適當(dāng)?shù)姆椒ㄒ种苹驕p少該密度感應(yīng)分子的生成,能成為混合微生物生物膜感染控制的新思路；對羥基苯乙醇能提高生物膜形成能力,提高生長動力學(xué),促進生物膜形成。其對生物膜的作用可能是對icaA、aap、fbe基因的上調(diào)和als3、hwp1、e fg1基因下調(diào)綜合作用的結(jié)果。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R318.08
【文章目錄】：
中英文縮略詞對照表
中文摘要
英文摘要
引言
第一部分
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻
第二部分
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻
第三部分
    參考文獻
攻讀博士期間參與課題
攻讀博士期間發(fā)表文章
致謝

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 車付彬;徐楠;陳江漢;;病原真菌中群體感應(yīng)現(xiàn)象研究進展[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2009年04期

2 奚廷斐;生物材料進展(一)[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2004年03期

3 奚廷斐;生物材料進展(二)[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2004年04期

4 汪長中;程惠娟;;藥物協(xié)同抗生物膜研究進展[J];藥學(xué)學(xué)報;2012年03期

5 丁進亞;黃前川;徐娟;陳鵬;曹軍皓;;置入性導(dǎo)管相關(guān)感染的病原菌與生物被膜形成[J];醫(yī)學(xué)綜述;2012年06期

6 鄭璐;余加林;蘆起;劉官信;;白色念珠菌生物膜體外模型的建立及不同檢測方法比較[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2010年05期

7 邱俠;張流波;;醫(yī)用材料上細菌生物膜研究進展[J];中國消毒學(xué)雜志;2009年03期

8 陳波曼;余加林;劉官信;胡琳燕;李祿全;李芳;楊華;;機械通氣新生兒氣管導(dǎo)管表面細菌生物膜的掃描電鏡觀察及其與下呼吸道感染的關(guān)系[J];中華兒科雜志;2007年09期

9 葉聯(lián)華;黃云超;楊達寬;李莉;許賡;趙光強;郭鳳麗;楊立民;;葡萄糖對胸心外科聚氯乙烯材料細菌ica操縱子表型的影響[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2007年05期

10 李燕;李冬冬;陶傳敏;宋鄉(xiāng);;表皮葡萄球菌生物膜形成及相關(guān)基因的檢測及評價[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2010年04期

本文編號：2829246