本文關(guān)鍵詞：Fbxw7參與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:肝細(xì)胞肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是人類最常見的惡性腫瘤之一,其在腫瘤相關(guān)疾病中的發(fā)病率和死亡率一直居高不下。在我國(guó),肝癌在所有腫瘤中發(fā)病率居第四位,而死亡率在腫瘤相關(guān)性死亡中居第二位。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步,盡管出現(xiàn)了日益先進(jìn)的診斷技術(shù),漸漸規(guī)范精湛的外科手術(shù),還有逐步改善的輔助性化療,甚至肝移植技術(shù)的普及,可是肝癌患者的預(yù)后依然不容樂觀。這都是由于肝癌的隱匿性發(fā)展和不可預(yù)知的轉(zhuǎn)移,多數(shù)患者在就診時(shí)就已經(jīng)失去了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī),而術(shù)后復(fù)發(fā)和腫瘤耐藥問題,更是導(dǎo)致肝癌患者死亡的決定性因素。談“肝癌”色變,仍然是當(dāng)前患者和醫(yī)生的深刻感觸。醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展,離不開醫(yī)學(xué)科研的不斷進(jìn)步,迄今為止,世界各地的學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種和肝癌生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等相關(guān)的分子及通路機(jī)制,而科研中取得的成果,諸如分子靶向治療,干細(xì)胞治療等等也在慢慢的向臨床轉(zhuǎn)化。治愈肝癌任重而道遠(yuǎn),其困難源于肝癌背后的機(jī)制過于復(fù)雜,另外,90%以上腫瘤患者的死亡歸因于轉(zhuǎn)移的發(fā)生,因此,研究腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制和預(yù)防具有非常重要的意義。自從泛素—蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)被發(fā)現(xiàn)后,多方證實(shí)其參與了細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、周期調(diào)控、凋亡與分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)過程,是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾體系。其中泛素連接酶E3中最核心的F-box蛋白—Fbxw7(F-box and WD repeat domain-containing protein 7),可識(shí)別多個(gè)原癌蛋白并參與其泛素化和降解,發(fā)揮著抑制腫瘤的生物學(xué)功能,近年研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中Fbxw7發(fā)生了基因突變或表達(dá)降低。Fbxw7蛋白是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一,比較集中的研究方向有干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸,腫瘤增殖和侵襲,耐藥等等。但在肝癌方面的研究為數(shù)不多,集中涉及其在肝癌組織的表達(dá)情況及對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響,目前國(guó)內(nèi)外還未見有Fbxw7在肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的機(jī)制的報(bào)導(dǎo),因此,本課題設(shè)計(jì)并施行了以下研究,為探求Fbxw7在肝癌轉(zhuǎn)移中是否起到了作用及其作用機(jī)制有哪些。方法:我們首先收集并隨訪了102例肝癌患者的組織標(biāo)本,石蠟包埋并切片,利用免疫組化染色來觀察Fbxw7在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)情況,并與患者的臨床病理資料結(jié)合來分析Fbxw7對(duì)于肝癌的意義,隨后用Real-time PCR和Western-blot的方法檢測(cè)了肝癌細(xì)胞系中Fbxw7的m RNA和蛋白水平的表達(dá)。接下來我們構(gòu)建了能夠穩(wěn)定下調(diào)/上調(diào)Fbxw7的病毒載體并轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系,使肝癌細(xì)胞系可以穩(wěn)定下調(diào)/上調(diào)Fbxw7的表達(dá),繼而使用Real-time PCR,Western-blot,ELISA,Transwell實(shí)驗(yàn),構(gòu)建裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染病毒后的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)的改變,并探索其中涉及到的機(jī)制。結(jié)果:1.免疫組化染色結(jié)果得知在肝癌組織中Fbxw7的表達(dá)比癌旁組織中要低。與臨床病理特征結(jié)合的分析結(jié)果顯示,高Fbxw7水平和低Fbxw7水平組患者之間,腫瘤分化(P=0.013),脈管浸潤(rùn)(P=0.031),轉(zhuǎn)移(P=0.027)和AJCC腫瘤分期(P=0.047)都是有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的。Kaplan-Meier法生存分析提示,高Fbxw7表達(dá)組患者有著更長(zhǎng)的生存時(shí)間(log-rank,P0.001)。單因素和多因素Cox回歸分析均表明,低Fbxw7表達(dá)能夠作為肝癌患者預(yù)后較差的獨(dú)立指標(biāo)。2.以肝細(xì)胞系HL-7702為對(duì)照,使用Real-time PCR和Western-blot檢測(cè)了肝癌細(xì)胞系Hep G2,SMMC7721和MHCC97H中Fbxw7的表達(dá)情況,結(jié)果提示,肝癌細(xì)胞系中Fbxw7的表達(dá)明顯低于肝細(xì)胞系(P0.05),且在Hep G2,SMMC7721和MHCC97H中Fbxw7的表達(dá)水平是依次降低的。3.構(gòu)建上調(diào)Fbxw7的GV341-puro慢病毒載體和下調(diào)Fbxw7的GV118-GFP慢病毒載體,根據(jù)細(xì)胞系中Fbxw7的相對(duì)高低水平選擇了在Hep G2中下調(diào)Fbxw7,在MHCC97H中上調(diào)Fbxw7,轉(zhuǎn)染完畢后通過Real-time PCR和Western-blot檢測(cè)過表達(dá)和干擾效果,成功構(gòu)建了KD-Fbxw7-G2和OE-Fbxw7-97H,他們各自的對(duì)照為NC-Fbxw7-G2和NC-Fbxw7-97H。4.在確定了病毒本身對(duì)細(xì)胞活力無影響的前提下,通過Transwell實(shí)驗(yàn)及裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),下調(diào)了Fbxw7表達(dá)的KD-Fbxw7-G2細(xì)胞的侵襲和遷移能力較對(duì)照細(xì)胞有明顯的增強(qiáng),而上調(diào)了Fbxw7表達(dá)的OE-Fbxw7-97H細(xì)胞的侵襲和遷移能力比對(duì)照細(xì)胞有明顯的減弱。5.通過Western-blot,Real-time PCR及ELISA檢測(cè)了KD-Fbxw7-G2和OE-Fbxw7-97H細(xì)胞中活化的Notch1的變化情況,并檢測(cè)了ERK1/2通路的活化情況及MMP-2,MMP-9和u PA的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑制Fbxw7的表達(dá)可以上調(diào)Notch1的NICD的表達(dá),并激活ERK1/2,繼而使MMP-2,MMP-9和u PA表達(dá)增加,而使用Notch1的小干擾RNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干擾后,本已增強(qiáng)的細(xì)胞遷移和侵襲的能力發(fā)生了回落。結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明,Fbxw7可以用于肝癌患者的預(yù)后標(biāo)志物;Fbxw7在肝癌的進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用,并首次發(fā)現(xiàn)了Fbxw7可能通過Fbxw7/Notch1/ERK1/2軸來調(diào)控肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
【關(guān)鍵詞】：肝細(xì)胞肝癌 Fbxw7 轉(zhuǎn)移和侵襲 Notch1
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-34
• 第一部分 Fbxw7在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其臨床意義34-50
• 引言34
• 1 材料34-36
• 2 方法36-42
• 3 結(jié)果42-47
• 4 討論47-50
• 第二部分 構(gòu)建Fbxw7干擾、過表達(dá)慢病毒載體并穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系50-65
• 引言50
• 1 材料50-54
• 2 方法54-60
• 3 結(jié)果60-63
• 4 討論63-65
• 第三部分 Fbxw7對(duì)肝癌細(xì)胞系侵襲和轉(zhuǎn)移的影響65-81
• 引言65
• 1 材料65-67
• 2 方法67-73
• 3 結(jié)果73-78
• 4 討論78-81
• 第四部分 Fbxw7調(diào)控肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究81-95
• 引言81
• 1 材料81-83
• 2 方法83-86
• 3 結(jié)果86-93
• 4 討論93-95
• 小結(jié)95-96
• 參考文獻(xiàn)96-116
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果116-118
• 致謝118-119

  本文關(guān)鍵詞：Fbxw7參與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：282725