本文關鍵詞：Fbxw7參與肝癌侵襲和轉移的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:肝細胞肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是人類最常見的惡性腫瘤之一,其在腫瘤相關疾病中的發(fā)病率和死亡率一直居高不下。在我國,肝癌在所有腫瘤中發(fā)病率居第四位,而死亡率在腫瘤相關性死亡中居第二位。隨著醫(yī)療技術的不斷進步,盡管出現(xiàn)了日益先進的診斷技術,漸漸規(guī)范精湛的外科手術,還有逐步改善的輔助性化療,甚至肝移植技術的普及,可是肝癌患者的預后依然不容樂觀。這都是由于肝癌的隱匿性發(fā)展和不可預知的轉移,多數(shù)患者在就診時就已經(jīng)失去了手術的最佳時機,而術后復發(fā)和腫瘤耐藥問題,更是導致肝癌患者死亡的決定性因素。談“肝癌”色變,仍然是當前患者和醫(yī)生的深刻感觸。醫(yī)學的飛速發(fā)展,離不開醫(yī)學科研的不斷進步,迄今為止,世界各地的學者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種和肝癌生長、增殖、轉移、耐藥等相關的分子及通路機制,而科研中取得的成果,諸如分子靶向治療,干細胞治療等等也在慢慢的向臨床轉化。治愈肝癌任重而道遠,其困難源于肝癌背后的機制過于復雜,另外,90%以上腫瘤患者的死亡歸因于轉移的發(fā)生,因此,研究腫瘤轉移的機制和預防具有非常重要的意義。自從泛素—蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)被發(fā)現(xiàn)后,多方證實其參與了細胞的基因轉錄、周期調控、凋亡與分化、信號轉導和細胞發(fā)育等多個生物學過程,是一種重要的蛋白質翻譯后修飾體系。其中泛素連接酶E3中最核心的F-box蛋白—Fbxw7(F-box and WD repeat domain-containing protein 7),可識別多個原癌蛋白并參與其泛素化和降解,發(fā)揮著抑制腫瘤的生物學功能,近年研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中Fbxw7發(fā)生了基因突變或表達降低。Fbxw7蛋白是當前研究的熱點之一,比較集中的研究方向有干細胞和腫瘤干細胞的轉歸,腫瘤增殖和侵襲,耐藥等等。但在肝癌方面的研究為數(shù)不多,集中涉及其在肝癌組織的表達情況及對肝癌細胞增殖的影響,目前國內外還未見有Fbxw7在肝癌侵襲和轉移中的機制的報導,因此,本課題設計并施行了以下研究,為探求Fbxw7在肝癌轉移中是否起到了作用及其作用機制有哪些。方法:我們首先收集并隨訪了102例肝癌患者的組織標本,石蠟包埋并切片,利用免疫組化染色來觀察Fbxw7在肝癌和癌旁組織中的表達情況,并與患者的臨床病理資料結合來分析Fbxw7對于肝癌的意義,隨后用Real-time PCR和Western-blot的方法檢測了肝癌細胞系中Fbxw7的m RNA和蛋白水平的表達。接下來我們構建了能夠穩(wěn)定下調/上調Fbxw7的病毒載體并轉染至肝癌細胞系,使肝癌細胞系可以穩(wěn)定下調/上調Fbxw7的表達,繼而使用Real-time PCR,Western-blot,ELISA,Transwell實驗,構建裸鼠肺轉移模型等實驗方法檢測轉染病毒后的肝癌細胞轉移相關指標的改變,并探索其中涉及到的機制。結果:1.免疫組化染色結果得知在肝癌組織中Fbxw7的表達比癌旁組織中要低。與臨床病理特征結合的分析結果顯示,高Fbxw7水平和低Fbxw7水平組患者之間,腫瘤分化(P=0.013),脈管浸潤(P=0.031),轉移(P=0.027)和AJCC腫瘤分期(P=0.047)都是有明顯的統(tǒng)計學差異的。Kaplan-Meier法生存分析提示,高Fbxw7表達組患者有著更長的生存時間(log-rank,P0.001)。單因素和多因素Cox回歸分析均表明,低Fbxw7表達能夠作為肝癌患者預后較差的獨立指標。2.以肝細胞系HL-7702為對照,使用Real-time PCR和Western-blot檢測了肝癌細胞系Hep G2,SMMC7721和MHCC97H中Fbxw7的表達情況,結果提示,肝癌細胞系中Fbxw7的表達明顯低于肝細胞系(P0.05),且在Hep G2,SMMC7721和MHCC97H中Fbxw7的表達水平是依次降低的。3.構建上調Fbxw7的GV341-puro慢病毒載體和下調Fbxw7的GV118-GFP慢病毒載體,根據(jù)細胞系中Fbxw7的相對高低水平選擇了在Hep G2中下調Fbxw7,在MHCC97H中上調Fbxw7,轉染完畢后通過Real-time PCR和Western-blot檢測過表達和干擾效果,成功構建了KD-Fbxw7-G2和OE-Fbxw7-97H,他們各自的對照為NC-Fbxw7-G2和NC-Fbxw7-97H。4.在確定了病毒本身對細胞活力無影響的前提下,通過Transwell實驗及裸鼠肺轉移模型的構建實驗發(fā)現(xiàn),下調了Fbxw7表達的KD-Fbxw7-G2細胞的侵襲和遷移能力較對照細胞有明顯的增強,而上調了Fbxw7表達的OE-Fbxw7-97H細胞的侵襲和遷移能力比對照細胞有明顯的減弱。5.通過Western-blot,Real-time PCR及ELISA檢測了KD-Fbxw7-G2和OE-Fbxw7-97H細胞中活化的Notch1的變化情況,并檢測了ERK1/2通路的活化情況及MMP-2,MMP-9和u PA的表達變化,結果發(fā)現(xiàn),抑制Fbxw7的表達可以上調Notch1的NICD的表達,并激活ERK1/2,繼而使MMP-2,MMP-9和u PA表達增加,而使用Notch1的小干擾RNA對細胞進行干擾后,本已增強的細胞遷移和侵襲的能力發(fā)生了回落。結論:我們的研究結果表明,Fbxw7可以用于肝癌患者的預后標志物;Fbxw7在肝癌的進展中發(fā)揮了重要的作用,并首次發(fā)現(xiàn)了Fbxw7可能通過Fbxw7/Notch1/ERK1/2軸來調控肝癌細胞的侵襲和轉移能力。
【關鍵詞】：肝細胞肝癌 Fbxw7 轉移和侵襲 Notch1
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-34
• 第一部分 Fbxw7在肝細胞肝癌中的表達及其臨床意義34-50
• 引言34
• 1 材料34-36
• 2 方法36-42
• 3 結果42-47
• 4 討論47-50
• 第二部分 構建Fbxw7干擾、過表達慢病毒載體并穩(wěn)轉肝癌細胞系50-65
• 引言50
• 1 材料50-54
• 2 方法54-60
• 3 結果60-63
• 4 討論63-65
• 第三部分 Fbxw7對肝癌細胞系侵襲和轉移的影響65-81
• 引言65
• 1 材料65-67
• 2 方法67-73
• 3 結果73-78
• 4 討論78-81
• 第四部分 Fbxw7調控肝癌細胞侵襲和轉移的機制研究81-95
• 引言81
• 1 材料81-83
• 2 方法83-86
• 3 結果86-93
• 4 討論93-95
• 小結95-96
• 參考文獻96-116
• 個人簡歷和研究成果116-118
• 致謝118-119

  本文關鍵詞：Fbxw7參與肝癌侵襲和轉移的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：282725