本文關鍵詞：趨化因子CXCL16對霍奇金淋巴瘤HRS細胞及其背景Treg細胞的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, H L)是西方人群常見的淋巴系統惡性腫瘤,大約占其惡性淋巴瘤11%左右。近年來HL發(fā)病率在我國亦有上升趨勢。臨床上,HL具有較好的預后。經過早期診斷和規(guī)范化治療,大多數HL患者可以達到臨床痊愈,但仍有兩成患者最終死于腫瘤復發(fā)或者進展。組織學上,HL被分為經典型霍奇金淋巴瘤(Classical Hodgkin lymphoma, CHL)和結節(jié)性淋巴細胞為主型霍奇金淋巴瘤(nodular lymphocyte predominant Hodgkin lymphoma, NLPHL),其中CHL占HL絕大多數(95%左右),又分為4個亞型：結節(jié)硬化型、混合細胞型、淋巴細胞豐富型和淋巴細胞消減型。HL具有相當獨特的病理形態(tài)學特征,即腫瘤的惡性成分即診斷性腫瘤細胞霍奇金/里-斯(Hodgkin/Reed-Sternberg, HRS)細胞僅占腫瘤組織的極少部分(1%),絕大部分為大量非腫瘤性的炎性背景,包括T、B淋巴細胞、中性粒細胞、漿細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、成纖維細胞等。因此,研究HL既要注意腫瘤性HRS細胞,也要關注背景免疫細胞及其細胞因子構成的微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境形成對HL至關重要。研究發(fā)現,HRS細胞可分泌多種細胞因子/趨化因子,通過自分泌形式作用于自身表面受體,或者以旁分泌形式吸引和調節(jié)背景基質細胞。而其周圍的背景炎性細胞也分泌大量細胞因子/趨化因子,反作用于HRS細胞。二者相互作用,形成“對話”,構成一個復雜的分子網絡,共同維系HRS細胞的存活、增殖、抗凋亡、遷移以及逃避宿主免疫。HL背景細胞大部分為CD4+T細胞,其中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(T regulatory,Treg)作用引人關注。Treg細胞可抑制細胞毒性淋巴細胞(cytotoxic 1ymphocyte,CTL)活性,發(fā)揮免疫抑制功能,協助HRS細胞完成免疫逃避。HRS細胞可通過釋放某些細胞因子/趨化因子將Treg細胞吸引到自身周圍并維持其生存及活化。為了探討HL微環(huán)境形成及相關細胞因子/趨化因子在其中的作用,本課題組前期利用GeneSifter在線軟件和BRB-ArrayTools分析平臺對公共基因芯片數據庫GEO(Gene Expression Omnibus)中的CHL病變組織分離的HRS細胞、CHL細胞株(L428)、Burkitt淋巴瘤細胞株(Raji)以及彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)病人腫瘤組織的基因芯片表達數據分別進行了統計學分析。結果發(fā)現除了已闡明的CCL5、CCL22、CCL17、SISd和IL-6等因子以外,新型趨化因子CXCL16及其受體CXCR6也與HL關系密切。進一步比較CXCL16/CXCR6在CHL和DLBCL中表達差異,發(fā)現二者表達在CHL中均明顯高于DLBCL:利用基因沉默技術建立鼠源性類人霍奇金淋巴瘤模型,其中CXCL16表達明顯上調。CXCL16及其受體CXCR6在人霍奇金淋巴瘤的表達和作用究竟如何?這引起了我們的研究興趣。CXCL16是新近發(fā)現的趨化因子,屬于CXC家族,具有膜結合型(TM-CXCL16)和分泌型(sCXCL6)兩種存在形式。CXCL16主要表達于Th1細胞、NK細胞以及激活的CD8+T細胞以及抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell,APC)和巨噬細胞等,其受體CXCR6則表達于未分化CD8+T細胞、自然殺傷T(natural killer T, NKT)細胞.CD4+和CD8+T細胞等.CXCL16/CXCR6參與了細胞免疫應答、細胞粘附、抗原遞呈、炎癥反應以及胸腺T細胞發(fā)育等。關于CXCL16的早期報道多集中在炎癥及免疫相關疾病中,研究顯示CXCL16在諸如動脈粥樣硬化、風濕性關節(jié)炎、肝炎、肺炎、腎炎以及HIV感染中均扮演了重要作用。近年來,CXCL16及其受體CXCR6在腫瘤中的作用引起研究者密切關注。CXCL16/CXCR6在多種惡性腫瘤中高表達,如結直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、腎癌等。報道顯示在多數腫瘤中CXCL16表達可促進其生長、轉移和復發(fā),但在有些腫瘤中作用卻相反。此外,CXCL16/CXCR6還可通過誘導CD4+/CD8+T細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞參與抗腫瘤免疫以及腫瘤微環(huán)境的形成。雖然CXCL16及其受體CXCR6作為一對趨化因子軸常見表達于免疫細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞和巨噬細胞等,但其在淋巴造血系統腫瘤中卻少見研究。Hanamoto等最早在分析HL中趨化因子表達情況時注意到HL來源細胞株中存在一定程度CXCL16的表達,但未能深入研究這種表達的實際意義。Darash-Yahana在一項炎癥相關腫瘤研究中檢測了28例淋巴瘤組織中CXCL16的表達情況,其中25%存在CXCL16高表達,但并未提及所研究淋巴瘤組織類型以及這種表達的意義。Deutsch等則注意到CXCL16/CXCR6在淋巴瘤惡性轉化中的作用,即胃粘膜相關淋巴瘤(MALT)向彌漫大B淋巴瘤轉化過程中常伴隨著CXCR6等趨化因子受體表達的上調。我們前期運用熒光定量PCR、免疫印跡、免疫熒光共聚焦以及酶聯免疫吸附試驗檢測了9株淋巴瘤細胞株(7株B細胞來源,2株T細胞來源)中CXCL16/CXCR6基因和蛋白表達情況,以分析不同來源淋巴瘤細胞株中CXCL16/CXCR6表達差異,結果顯示CXCL16/CXCR6在淋巴瘤細胞株廣泛表達,但不同來源細胞株中其表達水平存在差異,在HL細胞株L428以及某些NHL細胞株(如RPMI-8226、KM3和Jurkat細胞)CXCL16表達相對較高。細胞株是體外條件下培養(yǎng)的單純腫瘤細胞,缺乏微環(huán)境及營養(yǎng)和宿主免疫等影響,與體內腫瘤還存在較大區(qū)別。那么,CXCL16/CXCR6在淋巴瘤特別是HL體內腫瘤組織中的表達情況又是怎樣?其表達的臨床意義如何?CXCL16表達對于HL腫瘤性HRS細胞及其背景細胞的各有何種意義。這些均有待于進一步研究。H/RS細胞表型的形成與CD99基因低表達以及NF-κB信號通路持續(xù)活化相關。我們前期研究觀察了HL中CXCL16表達與CD99表達相關性以及其與NF-κB信號通路的關系,發(fā)現在L428細胞CXCL16表達與CD99表達相反,與NF-κB信號通路活化相關。P13K/AKT信號通路是HL又一重要的信號通路。P13K持續(xù)激活后可通過下游AKT和mTOR信號通路,促進HL腫瘤細胞增殖和遷徙。有研究顯示CXCL16可激活平滑肌細胞P13K/AKT及NF-κB信號通路,促進其增殖及細胞間粘附。在腫瘤,比如前列腺癌和肝癌中,CXCL16同樣可通過激活P13K/AKT信號通路促進其臨床進展。那么在HL中,CXCL16表達與這兩條通路關系如何,是不是通過這二者在起作用呢?鑒于此,CXCL16及其受體CXCR6在淋巴瘤特別是HL中的表達、意義及其分子機制即是本研究的目的所在。研究目的1.檢測CXCL16在淋巴瘤特別是HL組織標本中的表達情況及其臨床意義,延伸和完善課題組前期研究；2.研究CXCL16表達對HRS細胞增殖能力、遷移能力、細胞周期、凋亡以及免疫表型等生物學特性的影響,分析CXCL16在HL發(fā)生發(fā)展中的作用；3.研究CXCL16表達對HL背景Treg細胞的趨化及增殖能力的影響,觀察體外共培養(yǎng)條件下Treg細胞與L428細胞相互作用,分析CXCL16在HL微環(huán)境形成中可能的作用；4.觀察HL腫瘤組織和細胞中P13K/AKT/mTOR信號通路及NF-κB信號通路激活情況及其對腫瘤細胞增殖和遷移的影響,探討CXCL16表達對上述信號通路的影響,分析CXCLl6對腫瘤細胞作用的分子機制。研究方法1.CXCL16/CXCR6在淋巴瘤組織及細胞中的表達選擇70例淋巴瘤(其中45例HL)組織標本,通過免疫組織化學法檢測CXCL16及其受體CXCR6蛋白表達情況,并結合相關臨床病理資料,分析其臨床意義；選擇4株淋巴瘤細胞,通過免疫細胞化學方法檢測細胞蠟塊中CXCL16/CXCR6蛋白表達情況,IPP6.0軟件分析陽性細胞光密度值,并與組織中的表達進行對比分析。延伸和完善課題組前期研究。2.CXC16表達對HRS細胞的作用利用慢病毒轉染建立過表達CXCL16的L428細胞亞系,并通過外源性添加重組可溶性CXCL16 (sCXCL16)蛋白以及CXCR6抗體分別上調或阻斷CXCL16的表達,再通過CCK-8增殖實驗、Transwell侵襲實驗、PI-Annexin V凋亡檢測及流式細胞術等方法,檢測腫瘤細胞增殖能力、遷移能力以及細胞周期、凋亡和免疫表型等細胞生物學特性改變。探討CXCL16表達對HRS細胞的作用。3.CXC16表達對HL微環(huán)境形成的影響免疫磁珠法從健康人外周血分離CD4+CD25+Treg細胞,通過Transwell和CCK-8實驗檢測CXCL16對Treg細胞體外趨化和增殖能力的影響,并觀察共培養(yǎng)條件下L428細胞和Treg細胞形態(tài)學改變以及各自增殖能力變化。探討CXCL16表達對HL微環(huán)境形成的影響。4. CXCL16對HL腫瘤細胞作用的分子機制首先通過免疫組織化學、免疫細胞化學和Western blot等方法檢測HL組織和細胞株中PI3K/AKT/mTOR 和 NF-κB信號通路中關鍵蛋白AKT、P70S6和IκB磷酸化水平；再觀察不同CXCL16表達水平時上述通路活化情況,分析CXCL16表達對上述通路的影響；最后觀察單獨添加P13K抑制劑LY294002以及聯合添加LY294002和sCXCL16對L428細胞增殖和遷移能力影響。結果1. CXCL16/CXCR6在淋巴瘤組織和細胞中的表達(1)淋巴瘤組織中,CXCL16蛋白表達在CHL組要高于NHL組(Z=-2.550,P=0.011)；在CHL組,CXCL16的表達與腫瘤大小有關(Z=-3.327,P=0.001),與性別(Z=-0.038,P=0.970)、年齡(Hc=0.092,P=0.955)、組織學亞型(Hc=1.802,P=0.614)無關；(2)淋巴瘤組織中,CXCR6的表達在CHL組和NHL組無顯著差異(Z=-1.850,P=0.064)；在CHL組,CXCR6的表達與腫瘤大小(Z=-1.841,P=0.066)、性別(Z=-0.275,P=0.784)、年齡(Hc=0.894,P==0.640)及組織學亞型(Hc=1.114,P=0.774)等臨床病理特征均無顯著相關；(3)CXCL16在各淋巴瘤細胞株間表達均存在統計學差異(均P0.05),其中L428的表達最高,其次是Karpass299、Raji和OCI-Ly10；CXCR6在各淋巴瘤細胞株間表達均存在統計學差異(均P0.05),L428的表達最低,其次是Raji、Ly10、和Karpass299；(4)在淋巴瘤組織中,CXCL16與CXCR6蛋白表達呈正相關(相關系數r=0.411,P=0.000),但在淋巴瘤細胞株中二者表達卻存在負相關(相關系數r=-0.764,P=0.000)。2.CXC16表達對HRS細胞的作用(1)慢病毒轉染過表達CXCL16的L428細胞亞系構建及鑒定構建CXCL16過表達慢病毒載體,穩(wěn)定轉染L428細胞。觀察轉染后細胞形態(tài)學變化,倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達證實轉染成功。熒光定量PCR檢測證實轉染亞系CXCL16基因表達上調,免疫印跡檢測證實轉染亞系CXCL16總蛋白表達上調,ELISA檢測證實轉染亞系細胞外分泌CXCL16增高；(2)不同CXCL16表達水平下L428細胞增殖能力CCK-8法檢測結果顯示,除第一天外,其余天各處理組細胞間增殖差別有統計學意義(P0.05)。內源性高表達CXCL16和外源性添加shCXCL16均能有效刺激L428細胞增殖(P0.05),但這兩種處理因素之間的刺激作用則差別不明顯(P0.05),添加外源性CXCL16受體抗體能降低L428體外增殖能力(P0.05)；(3)不同CXCL16表達水平下L428細胞遷移能力Transwell法檢測結果顯示,內源性高表達CXCL16和外源性添加sCXCL16均能有效促進L428細胞遷移(P0.05),但這兩種處理因素之間的刺激作用則差別不明顯(P0.05)；而添加外源性CXCL16受體抗體能降低L428遷移能力(P0.05)；穿膜后細胞繼續(xù)培養(yǎng)觀察證實L428中大細胞可由中等大小細胞轉化而來；(4)不同CXCL16表達水平下L428細胞周期變化流式細胞術檢測顯示,L428細胞與三個處理組細胞周期均存在統計學差異(均P0.001)。內源性過表達CXCL16和外源性添加sCXCL16均可使G1期細胞百分數明顯減少,相應處于S期和G2/M期細胞百分數明顯升高(P0.05),兩個處理組間各個周期細胞百分數則未見有統計學差異(P0.05)；而外源性添加CXCL16受體抗體則可使處于G1期細胞百分數明顯升高,S期和G2/M期細胞百分數則明顯降低(P0.05)；(5)不同CXCL16表達水平下L428細胞凋亡變化流式細胞術檢測顯示各處理組L428細胞凋亡率(%)如下：L428裸細胞組為5.69±0.32,L428-CXCL16+組為244±0.41,L428-sCXCL16組為2.37±0.37,L428-anti-CXCR6組為11.62±0.83。L428細胞組與三個處理組細胞凋亡均存在統計學差異(均P0.05),內源性過表達CXCL16和外源性添加sCXCL16均可降低L428細胞凋亡(P0.05),兩個處理組間各個周期則未見有統計學差異(P0.05)；而外源性添加CXCL16受體抗體則促進L428細胞凋亡(P0.05)；(6)不同CXCL16表達水平下L428細胞免疫表型變化流式細胞術檢測顯示不同CXCL16表達水平下L428細胞表面HRS細胞標記抗原CD15.CD30以及B細胞標記抗原CD19和CD20的陽性表達率未見統計學差異(均P0.05)。3.CXC16表達對HL微環(huán)境形成的影響(1)添加不同濃度sCXCL16實驗組與對照組下室Treg細胞OD值均存在統計學差異(均P0.05)；不同濃度sCXCL16實驗組間下室Treg細胞OD值也存在統計學差異(均P0.05),提示sCXCL16對Treg細胞具有趨化作用,其趨化能力隨著濃度增加而相應增加；(2)L428細胞和Treg細胞共培養(yǎng)形態(tài)學觀察：L428細胞成團性增加,細胞體積增大,形態(tài)學出現橢圓形、短梭形甚至折角樣形態(tài)改變；而Treg淋巴細胞在形態(tài)和數量變化并不明顯,但生存時間延長；(3)CCK-8法檢測共培養(yǎng)對L428細胞和Treg細胞增殖的影響,發(fā)現共培養(yǎng)時可分別促進二者體外增殖能力(均P0.05)：(4)CCK-8法檢測重組人IL-3對L428細胞增殖的影響,發(fā)現rIL-3可促進L428細胞體外增殖,而且濃度越高其促增殖能力越強(均P0.05)。4. CXCL16對HL腫瘤細胞作用的分子機制(1)免疫組織化學方法檢測HL組織標本中AKT、pAKT、P70S6、pP70S6、pIκB蛋白表達情況,顯示在HL組織標本中可檢測到AKT/mTOR 及 NF-κB信號通路存在不同程度的磷酸化水平,其中AKT和IκB磷酸化水平較弱,而P70S6磷酸化水平較強；(2)免疫細胞化學方法檢測HL細胞株L428中AKT、pAKT、P70S6、pP70S6、 pIκB蛋白表達情況,顯示在HL細胞中AKT/mTOR及NF-κB信號通路存在不同程度的磷酸化水平,其中P70S6和IκB磷酸化水平較弱,而AKT磷酸化水平較強；(3)免疫印跡法檢測CXCL16不同表達水平下L428細胞AKT/mTOR及NF-κB信號通路磷酸化水平,結果顯示外源性和內源性CXCL16表達上升均可提高AKT、P70S6及IκB蛋白磷酸化水平,而中和性CXCL16抗體和CXCR6抗體則可以降低上述通路的磷酸化水平。提示CXCL16可激活L428細胞AKT/mTOR及NF-κB信號通路。(4)免疫印跡法檢測外源性SCXCL16對L428細胞AKT/mTO R通路和NF-κB通路磷酸化水平作用與刺激時間的關系,結果顯示AKT/mTO R通路磷酸化水平在刺激45分鐘即達到峰值,而NF-KB通路磷酸化水平峰值則在刺激60分鐘以后；(5)PI3K抑制劑LY294002對L428細胞的影響。外源性添加LY294002可抑制L428細胞體外增殖和遷移能力,且抑制效果與濃度有關,濃度越高抑制越強；當sCXCL16與LY294002聯合使用時,LY294002可抑制sCXCL16對L428細胞促進體外增殖和遷移的作用,提示CXCL16對L428細胞的作用可能是通過PI3K/AKT通路起作用。結論1.CXCL16及其受體CXCR6在淋巴瘤中廣泛表達,HL組織中CXCL16相對高表達,其表達與腫瘤大小有關；2.CXCL16可促進L428細胞體外增殖及遷移能力,抑制其凋亡,并增加S期和G2/M期細胞比率,但對L428細胞免疫表型無顯著影響；3. CXCL16可體外趨化Treg細胞,共培養(yǎng)的Treg細胞和L428細胞可促進彼此增殖；4. CXCL16可能通過激活PI3K/AKT/mTOR及NF-κB信號通路影響L428細胞生物學特性。創(chuàng)新之處1.本研究首次系統探究了趨化因子CXCL16及其受體CXCR6在淋巴瘤組織和細胞中的表達情況,并特別分析了其表達在HL的臨床意義,為深入探索HL細胞因子/趨化因子網絡奠定了基礎；2.本研究通過內源性及外源性調控CXCL16在L428中的表達,系統分析了CXCL16對HRS細胞的作用及其涉及的胞內信號通路,為深入探索HRS細胞分子網絡提供了線索,也為HL生物治療提供了潛在靶點；3.本研究通過體外模擬HRS細胞微環(huán)境,初步探究了CXCL16對于HL最重要的背景Treg細胞的作用以及L428細胞細胞與Treg細胞的相互作用,為闡明HL微環(huán)境形成提供了線索,也為HL免疫治療提供了新的思路。
【關鍵詞】：霍奇金淋巴瘤 人HL細胞株L428 霍奇金/里-斯細胞 CXC型趨化因子配體16 CXC型趨化因子受體6 微環(huán)境 調節(jié)性T淋巴細胞
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.1
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-27
• 前言27-48
• 一、霍奇金淋巴瘤及其腫瘤微環(huán)境27-29
• 二、趨化因子CXCL16及其受體CXCR629-36
• 三、PI3K/AKT/mTOR及NF-κB信號通路與霍奇金淋巴瘤36-40
• 參考文獻40-48
• 技術路線48-50
• 第一章 CXCL16/CXCR6在淋巴瘤組織及細胞株中的表達檢測50-69
• 一、材料和方法50-53
• 二、結果53-62
• 三、討論62-64
• 參考文獻64-69
• 第二章 CXCL16表達對霍奇金淋巴瘤HRS細胞的影響69-108
• 一、材料和方法69-83
• 二、結果83-102
• 三、討論102-105
• 參考文獻105-108
• 第三章 CXCL16對霍奇金淋巴瘤背景Treg淋巴細胞的影響108-129
• 一、材料和方法108-113
• 二、結果113-123
• 四、討論123-125
• 參考文獻125-129
• 第四章 CXCL16表達與L428細胞PI3K/AKT/mTOR和NF-κB信號通路的關系129-150
• 一、材料和方法129-132
• 二、結果132-144
• 三、討論144-146
• 參考文獻146-150
• 英文縮略詞表150-152
• 全文小結152-155
• 附錄155-173
• 附錄一、人類趨化因子及其受體家族155-158
• 附錄二：綜述158-173
• 參考文獻165-173
• 攻讀學位期間研究成果173-175
• 致謝175-178
• 統計學證明178

  本文關鍵詞：趨化因子CXCL16對霍奇金淋巴瘤HRS細胞及其背景Treg細胞的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：281785