研究背景與目的腎母細(xì)胞瘤又稱腎胚胎瘤。1899年Max Wilms醫(yī)生首先對(duì)其做了詳細(xì)的描述,故又稱Wilms瘤(Wilms tumor)。腎母細(xì)胞瘤是兒童最常見的原發(fā)于腎臟的惡性腫瘤。在過去的幾十年中通過手術(shù)、化療和放療的綜合治療腎母細(xì)胞瘤的預(yù)后較以往有了很大的改善,長(zhǎng)期生存率明顯提高。但對(duì)于間變型、雙側(cè)腎母細(xì)胞瘤和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)者,盡管通過長(zhǎng)春新堿(Vincristine,VCR)、放線菌素D、阿霉素、環(huán)磷酰胺等藥物的長(zhǎng)期化療,患兒生存率仍然較低且易出現(xiàn)嚴(yán)重的化療副作用。長(zhǎng)春新堿是腎母細(xì)胞瘤的一線化療藥物,但是長(zhǎng)春新堿在化療過程中容易產(chǎn)生腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象,導(dǎo)致化療療效降低。而且長(zhǎng)春新堿對(duì)骨髓的抑制程度、神經(jīng)系統(tǒng)的刺激性以及注射局部正常組織的刺激性較大,限制了其臨床應(yīng)用范圍和劑量的增加,限制了療效的提高,尤其是對(duì)于高危腎母細(xì)胞瘤患兒,常常需要大劑量化療和聯(lián)合化療,有時(shí)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的化療副作用。如何降低化療強(qiáng)度,減少化療劑量及化療時(shí)間進(jìn)而減少化療的毒副作用,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性以改善化療效果進(jìn)而提高患兒的生存率是目前腎母細(xì)胞瘤的重要研究方向。因此迫切需要尋找新的化療藥物或聯(lián)合用藥方案以提高化療效果并減輕化療的毒副作用。目前臨床上往往采用聯(lián)合用藥的方法降低長(zhǎng)春新堿的毒性并提高其療效。近年來研究?jī)A向于尋找具有抗腫瘤活性的化合物或臨床藥物與長(zhǎng)春新堿聯(lián)合應(yīng)用,以便在不增加細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)上,增加腫瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性。穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide,AND)是從中藥穿心蓮中提取出來的最具活性的成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯除了具有抗炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用以外,在抗腫瘤方面也具有良好的生物活性,它對(duì)胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞均具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用。穿心蓮內(nèi)酯主要通過兩種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),一是通過激活促凋亡的JNK通路、抑制抗凋亡的PI3K/AKT和ERK通路、激活ERK-p53凋亡通路或經(jīng)Caspase依賴性凋亡引起凋亡性細(xì)胞死亡,二是通過細(xì)胞周期阻滯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。此外還有研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯能增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。但至今為止鮮有研究報(bào)道穿心蓮內(nèi)酯對(duì)腎母細(xì)胞瘤的抗腫瘤作用。穿心蓮內(nèi)酯對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞是否也同樣具有生長(zhǎng)抑制作用,它是否會(huì)增加腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的化療敏感性,由此我們開展了相關(guān)研究。本研究通過體外培養(yǎng)人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞和建立裸鼠皮下移植瘤模型,結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,為穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合用藥成為腎母細(xì)胞瘤的一個(gè)新化療方案提供理論依據(jù)。方法1.細(xì)胞培養(yǎng)與處理方法:將人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞株保存于含15%熱滅活胎牛血清的Maccyo' 5培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO2、100%濕度的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。SK-NEP-1細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行處理,處理方法分別如下:(1)將VCR和AND分別用二甲基亞砜溶劑(DMSO)進(jìn)行溶解,然后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中,VCR的濃度分別為3、6、9、12、15nM, AND的濃度分別為5、10、15、20、25μM;(2) VCR和AND用DMSO溶解后一起加入細(xì)胞培養(yǎng)液中,VCR的濃度為半數(shù)抑制濃度(IC 50),AND的濃度分別為10、20、25μM;(3)細(xì)胞使用蛋白激酶B(AKT)活化劑SC-79預(yù)處理6小時(shí),VCR用DMSO溶解后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中,VCR的濃度為10.8nM;(4)細(xì)胞使用SC-79預(yù)處理6小時(shí),VCR和AND用DMSO溶解后一起加入細(xì)胞培養(yǎng)液中,VCR的濃度為10.8nM,AND的濃度為25μMAND。對(duì)照組為將以上各濃度實(shí)驗(yàn)組相同量的DMSO加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。處理時(shí)間按實(shí)驗(yàn)需要分別設(shè)置為24、48和72小時(shí)。2.細(xì)胞增殖檢測(cè):使用Cell Counting Kit-8 (CCK-8試劑盒)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖情況。使用GraphPad Prism 6.0軟件計(jì)算一系列的劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)獲得單獨(dú)使用或與AND聯(lián)合應(yīng)用時(shí)VCR的半數(shù)抑制濃度(IC50)。采用CompuSyn軟件進(jìn)行聯(lián)合用藥分析,生成不同濃度的VCR和AND組合時(shí)的聯(lián)合指數(shù)(CI),其中可加性、協(xié)同性和拮抗性分別由0.9-1.1,0.9和1.1的數(shù)值反映。3.細(xì)胞凋亡及Caspase-3 (半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶)活性檢測(cè):應(yīng)用Annexin V/PI雙染色法對(duì)各組凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色并采用FACScan流式細(xì)胞儀分析。采用Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3的活性。4.細(xì)胞自噬檢測(cè):使用單丹磺酰尸胺染色(MDC法)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,采用配備過濾系統(tǒng)的熒光顯微鏡進(jìn)行觀察自體吞噬泡并計(jì)數(shù)和拍照。采用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)檢查有無(wú)自噬體。5.蛋白印跡法(Western blotting)檢測(cè) ERK、p-ERK、p53、p-p53、AKT、p-AKT等細(xì)胞蛋白的表達(dá)水平。6.裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn):使用BALB/c裸鼠建立SK-NEP-1皮下移植腫瘤模型,購(gòu)買裸鼠45只,建立模型成功32只。裸鼠模型建立后隨機(jī)分入四組:對(duì)照組(生理鹽水,口服,每日一次)、100mg/kg的AND治療組(口服,每日一次)、0.2mg/kg的VCR治療組(腹腔注射,每周一次)、VCR和AND聯(lián)合治療組,每組8只,連續(xù)給藥4周。每周測(cè)量一次腫瘤體積和裸鼠體重。4周后處死裸鼠,解剖裸鼠剝離原位瘤后測(cè)量瘤重,計(jì)算抑瘤率,抑瘤率(%)=(對(duì)照組瘤重—治療組瘤重)/對(duì)照組瘤重X 100%。移植瘤切片后進(jìn)行TUNEL凋亡檢測(cè)及免疫組化分析。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x ±s)表示。多樣本兩組之間的比較采用單因素方差分析,取P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿對(duì)SK-NEP-1細(xì)胞具有協(xié)同抑制增殖作用:SK-NEP-1細(xì)胞按對(duì)照組、VCR (0-15 nM)組和AND (0-25μM)組分別處理24、48、72小時(shí),CCK-8法分析各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況。結(jié)果顯示長(zhǎng)春新堿的濃度越大、處理時(shí)間越長(zhǎng),SK-NEP-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率越高。而不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯組SK-NEP-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均較低。另外CCK-8法分析結(jié)果顯示穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合應(yīng)用時(shí)SK-NEP-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率高于VCR組。使用 GraphPad Prism 6.0 軟件計(jì)算出 VCR 的 IC50為 10.8nM,聯(lián)合應(yīng)用10μM、20μM、25μM AND 時(shí) VCR 的 IC50分別為 9.5nM、6.6 nM、5.1 nM, VCR+20μM AND 聯(lián)合應(yīng)用組與VCR組之間、VCR+25μM AND聯(lián)合應(yīng)用組與VCR組之間的差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。采用CompuSyn軟件進(jìn)行聯(lián)合用藥分析,生成10.8nM VCR分別與10μM、20μM、25μMAND組合時(shí)的聯(lián)合指數(shù),結(jié)果分別為0.98、0.66、0.58,提示穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿具有協(xié)同性。SK-NEP-1細(xì)胞分別按對(duì)照組、10.8nMVCR 組、10.8nMVCR+10μMAND 組、10.8nMVCR+20μMAND 組、10.8nM VCR+25μM AND組處理48小時(shí)后,采用倒置顯微鏡觀察顯示在穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合使用組可見到細(xì)胞數(shù)量明顯減少以及細(xì)胞形態(tài)的改變。2.穿心蓮內(nèi)酯促進(jìn)了長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的SK-NEP-1細(xì)胞凋亡,Caspase-3依賴性細(xì)胞凋亡參與這個(gè)過程:SK-NEP-1細(xì)胞分別按對(duì)照組、10.8 nM VCR組、10.8 nM VCR+10μM AND 組、10.8 nM VCR+20μM AND 組、10.8 nM VCR+25μM AND組處理48小時(shí),使用Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果顯示對(duì)照組早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)僅占5%,10.8 nM VCR組凋亡的細(xì)胞數(shù)為 32%,而 10.8 nMVCR 加用 10、20 和 25μM 的 AND 后顯著提高了 SK-NEP-1細(xì)胞的凋亡率,相應(yīng)的數(shù)值分別為39%、50%和56%。10.8nMVCR+20μMAND組、10.8nMVCR+25μMAND組分別與VCR組相比,兩者間的差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)了五組中Caspase-3底物分裂的比值用以分析Caspase-3的活性。10.8 nM VCR+20μM AND組和10.8 nM VCR+25μM AND組的Caspase-3的活性高于VCR組,兩者分別與VCR組之間的差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3.細(xì)胞自噬沒有參與穿心蓮內(nèi)酯和(或)長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的SK-NEP-1細(xì)胞死亡過程:SK-NEP-1細(xì)胞分別按對(duì)照組、10.8 nMVCR組、10.8 nMVCR+10μM AND 組、10.8 nM VCR+20μM AND 組、10.8 nM VCR+25μM AND 組處理 48 小時(shí),使用MDC法進(jìn)行染色,熒光顯微鏡觀察各組中自體吞噬泡的情況。結(jié)果顯示各組之間無(wú)明顯差別,MDC染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均不超過5%。透射電子顯微鏡觀察顯示各組細(xì)胞內(nèi)并無(wú)明顯的自噬體結(jié)構(gòu)形成。4.穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合應(yīng)用上調(diào)了 p-p53的蛋白表達(dá)水平并下調(diào)了p-AKT的表達(dá)水平:SK-NEP-1細(xì)胞分別按對(duì)照組、10.8 nMVCR組、10.8 nM VCR+1OμM AND 組、10.8 nM VCR+20μM AND 組、10.8 nM VCR+25μM AND組處理48小時(shí),采用Western blotting分析了五組中p-p53、p-AKT、p-ERK的表達(dá)水平。結(jié)果表明p-p53在五組中的表達(dá)水平逐漸升高,p-AKT的表達(dá)水平逐漸下降,而p-ERK的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。具體數(shù)據(jù)顯示p-p53的表達(dá)水平在10.8 nM VCR+20μM AND處理組中最高。5. AKT活化劑抑制了穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的SK-NEP-1細(xì)胞凋亡:SK-NEP-1細(xì)胞分別按對(duì)照組、VCR組、VCR+AND組、VCR+SC-79預(yù)處理組、VCR+AND+SC-79預(yù)處理組處理48小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。CCK-8法分別檢測(cè)了五組中細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率,結(jié)果顯示VCR+AND組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于VCR+AND+SC-79預(yù)處理組,兩者之間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而VCR組與VCR+SC-79預(yù)處理組間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blotting分析了五組中細(xì)胞蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示AKT活化劑SC-79抑制了穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合應(yīng)用時(shí)p-AKT和p-p53的表達(dá)水平變化。6.穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿顯著抑制了裸鼠皮下移植腫瘤的生長(zhǎng):裸鼠皮下移植腫瘤模型按實(shí)驗(yàn)分組治療4周,結(jié)果顯示在腫瘤體積及重量方面,VCR+AND組均低于對(duì)照組及VCR組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05) ; VCR組亦低于對(duì)照組,兩者之間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而AND組與對(duì)照組之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。移植瘤TUNEL凋亡檢測(cè)結(jié)果提示AND和VCR聯(lián)合治療組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,與對(duì)照組和VCR組相比,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05) , AND組與對(duì)照組之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。移植瘤免疫組化分析結(jié)果提示AND和VCR聯(lián)合治療組p-p53蛋白的表達(dá)水平最高,而p-AKT蛋白的表達(dá)水平最低,與對(duì)照組及VCR組相比,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿有效抑制了體外人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞和體內(nèi)SK-NEP-1細(xì)胞移植腫瘤的生長(zhǎng)。穿心蓮內(nèi)酯自身對(duì)SK-NEP-1細(xì)胞并沒有顯著的生長(zhǎng)抑制效果,但它增加了 SK-NEP-1細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性。2.穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿通過P13K-AKT-p53信號(hào)通路誘導(dǎo)SK-NEP-1細(xì)胞的凋亡。3. Caspase-3依賴性凋亡參與穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的SK-NEP-1細(xì)胞死亡過程。4.穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿對(duì)SK-NEP-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制不通過細(xì)胞自噬途徑。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R737.11
【部分圖文】：

我們采用ＣＣＫ－８法評(píng)估了長(zhǎng)春新堿及穿心蓮內(nèi)酯對(duì)ＳＫ－ＮＥＰ－１細(xì)胞的生長(zhǎng)逡逑抑制作用。首先檢測(cè)了長(zhǎng)春新堿和穿心蓮內(nèi)酯單獨(dú)使用對(duì)ＳＫ－ＮＥＰ－１細(xì)胞的抑制逡逑效果，如圖１Ａ所示長(zhǎng)春新堿抑制了邋ＳＫ－ＮＥＰ－１細(xì)胞的生長(zhǎng)，其作用呈劑量依賴逡逑性和時(shí)間依賴性，也就是說長(zhǎng)春新堿的濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)ＳＫ－ＮＥＰ－１逡逑細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果越明顯。而不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯對(duì)ＳＫ－ＮＥＰ－１細(xì)胞的生長(zhǎng)逡逑抑制效果均較差，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均不超過１５％邋（圖ＩＢ）。然后我們聯(lián)合應(yīng)用逡逑長(zhǎng)春新堿和穿心蓮內(nèi)酯對(duì)ＳＫ－ＮＥＰ－丨細(xì)胞進(jìn)行處理，如圖１Ｃ結(jié)果提示二者聯(lián)合逡逑應(yīng)用時(shí)ＳＫ－ＮＥＰ－１細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率高于單獨(dú)使用長(zhǎng)春新堿組。我們使用逡逑ＧｒａｐｈＰａｄ邋Ｐｒｉｓｍ邋６．０醫(yī)學(xué)繪圖軟件計(jì)算出單獨(dú)使用及聯(lián)用穿心蓮內(nèi)酷時(shí)長(zhǎng)春新堿逡逑的半數(shù)抑制濃度（ＩＣ邋５。），采用ＣｏｍｐｕＳｙｎ軟件進(jìn)行聯(lián)合用藥分析，生成１０．８ｎＭ逡逑長(zhǎng)春新堿分別與ｌ0ＨＭ、２０ｐＭ、２５ｐＭ穿心蓮內(nèi)酯組合時(shí)的聯(lián)合指數(shù)（ＣＩ）。結(jié)果逡逑如表一所示，單獨(dú)使用長(zhǎng)春新堿的ＩＣ５。為１０．８ｎＭ，聯(lián)合應(yīng)用１０ｐＭ、２0ｎＭ、２５＾Ｍ逡逑穿心蓮內(nèi)酯時(shí)長(zhǎng)春新堿的ＩＣ５。分別為９．５ｎＭ、６．６ｎＭ、５．１邋ｎＭ，ＶＣＲ＋２０（ｉＭＡＮＤ逡逑與ＶＣＲ之間、ＶＣＲ＋２５ｐＭＡＮＤ與ＶＣＲ之間的差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）；逡逑長(zhǎng)春新堿分別與１0＾Ｍ、２0ｈＭ、２５ｈＭ穿心蓮內(nèi)酯組合時(shí)的聯(lián)合指數(shù)分別為０．９８、逡逑０．６６、０．５８

將邋ＳＫ－ＮＥＰ－１邋細(xì)胞按對(duì)照組、ＶＣＲ邋組、ＶＣＲ＋１邋0ｎＭ邋ＡＮＤ邋組、ＶＣＲ＋２0ｎＭ逡逑ＡＮＤ組及ＶＣＲ＋２５ｐＭ邋ＡＮＤ組分別處理４８小時(shí)后采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)逡逑和密度，結(jié)果如圖２所示對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)和密度正常，而在穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春逡逑新堿聯(lián)合使用組可見到細(xì)胞數(shù)量明顯減少以及細(xì)胞形態(tài)的改變，這一結(jié)果與逡逑ＣＣＫ－８檢測(cè)結(jié)果一致。逡逑■■■■■逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐ＶＣＲ邐ＶＣＲ＋１０邐ＶＣＲ邋＋２０邐ＶＣＲ邋＋２５逡逑ＡＮＤ邋（ｐＭ）逡逑圖２倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量（ｘｌ00）逡逑二、Ｃａｓｐａｓｅ－３依賴性凋亡參與穿心蓮內(nèi)酯或（和）長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的逡逑ＳＫ－ＮＥＰ－１細(xì)胞死亡過程逡逑ＳＫ－ＮＥＰ－丨細(xì)胞分別按對(duì)照組、１０．８ｎＭＶＣＲ邋組、１０．８ｎＭＶＣＲ＋ｌ0ｎＭＡＮＤ逡逑組、１０．８ｎＭＶＣＲ＋２0ｎＭＡＮＤ邋組、丨０．８ｎＭＶＣＲ＋２５ｐＭＡＮＤ邋組處理邋４８邋小時(shí)后通逡逑過細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)試驗(yàn)（ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ雙染色法）檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡的情況。如圖３和逡逑圖４所示，對(duì)照組沒有明顯的細(xì)胞凋亡，早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞僅占５％。逡逑而后四組凋亡細(xì)胞的百分比逐漸增加

ＡＮＤ邋（｜ｊＭ）逡逑圖５各組細(xì)胞中Ｃａｓｐａｓｅ－３的活性逡逑：柱狀圖代表與對(duì)照組相比底物分解的百分比。＊＊Ｐ＜０．０１，對(duì)比ＶＣＲ組。逡逑、細(xì)胞自噬沒有參與穿心蓮內(nèi)酯或（和）長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的ＳＫ－ＮＥＰ－胞死亡過程逡逑細(xì)胞自噬染色檢測(cè)（ＭＤＣ法）己被廣泛報(bào)道用于自體吞噬泡的體外檢測(cè)［３６噬在很多癌細(xì)胞的凋亡中起重要作用［３７］。為了確定它是否在參與ＳＫ－ＮＥＰ胞的凋亡過程，本研究中ＳＫ－ＮＥＰ－１細(xì)胞按對(duì)照組、］０．８ｎＭＶＣＲ組、ｌ０．８ｎＣＲ＋ｌＯｐＭＡＮＤ邋組、１０．８ｎＭＶＣＲ＋２０ｇＭＡＮＤ邋組、１０．８ｎＭＶＣＲ＋２５ｎＭＡＮＤ邋理４８小時(shí)，采用ＭＤＣ法進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下得到的圖像顯示，無(wú)論使用ＶＣＲ組還是ＶＣＲ聯(lián)合ＡＮＤ組，自體吞噬泡的比例與對(duì)照組均無(wú)差異（，各組ＭＤＣ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均不超過５％邋（圖７）。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)

【參考文獻(xiàn)】

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1 李靜;劉偉;陳永順;;穿心蓮內(nèi)酯對(duì)S180荷瘤小鼠抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華腫瘤防治雜志;2016年S2期

2 李曙光;彭濤;趙軼峰;楊永江;黃迪;;穿心蓮內(nèi)酯體內(nèi)誘導(dǎo)人胃癌BGC823細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制探討[J];中華腫瘤防治雜志;2013年09期

3 邵艷華;王建剛;吳向維;丁平;賴小平;;穿心蓮種質(zhì)資源調(diào)查研究[J];中國(guó)現(xiàn)代中藥;2013年02期

4 呂巧莉;涂國(guó)剛;王嘉琦;李少華;;穿心蓮內(nèi)酯的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J];南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年01期

5 屈智慧;杜玉君;李相軍;郭蔚瑩;畢黎琦;趙穎;楊立志;;長(zhǎng)春新堿對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)的影響[J];中華腎臟病雜志;2012年07期

6 季旭明;歐陽(yáng)兵;吳智春;于華蕓;王春燕;李文華;;溫下方含藥血清誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡及對(duì)Bcl-2,Bax,p53蛋白表達(dá)的影響[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2011年12期

7 張國(guó)鋒;王家祥;;腎母細(xì)胞瘤78例臨床特點(diǎn)及生存分析[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2011年09期

8 覃華;張琰;韓艷;杜小燕;王茹;;穿心蓮內(nèi)酯對(duì)S180小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用的研究[J];科學(xué)技術(shù)與工程;2010年28期

9 任丹虹;方X;應(yīng)可凈;;穿心蓮內(nèi)酯對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞NF-κB通路的調(diào)控作用[J];中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2010年02期

10 沈凱凱;劉天瑜;徐沖;季莉莉;王崢濤;;穿心蓮內(nèi)酯抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及其對(duì)細(xì)胞內(nèi)周期調(diào)控相關(guān)蛋白的影響(英文)[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2009年09期

本文編號(hào)：2820805