背景：動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)中不穩(wěn)定斑塊破裂從而引發(fā)血栓的形成逐漸成為急性心血管事件的首要病因。因此,穩(wěn)定易損斑塊具有極為重要的臨床意義。病理學(xué)研究結(jié)果表明,不穩(wěn)定、易破裂的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊具有如下特征：持續(xù)性的炎癥反應(yīng),基質(zhì)降解,以及細(xì)胞死亡。這些改變最終導(dǎo)致纖維帽變薄,炎癥增多,壞死核心增大。斑塊內(nèi)新生血管是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的另一重要特征。隨著斑塊的進(jìn)展,新生血管數(shù)量及密度逐漸增多；在晚期斑塊中,脂質(zhì)、炎細(xì)胞等持續(xù)通過新生血管進(jìn)入斑塊內(nèi)部的主要通道,斑塊易損性隨著新生血管數(shù)量的增多而增大。斑塊內(nèi)新生血管因缺乏完整地基底膜和其他結(jié)締組織,因此具有脆性較大、滲透性較高等特點(diǎn),導(dǎo)致紅細(xì)胞及血液中的脂蛋白極易滲漏至斑塊內(nèi),加重斑塊內(nèi)脂質(zhì)的形成,導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的硬度降低,亦可引起炎癥細(xì)胞滲漏增多,從而增加了斑塊的不穩(wěn)定性。在多種因素的共同作用下,引發(fā)斑塊內(nèi)出血以及斑塊破裂。異常的斑塊內(nèi)膜及中膜血管新生被視為易損斑塊的標(biāo)志之一。血管新生受多種誘導(dǎo)因子和抑制因子的復(fù)雜調(diào)控,其中涉及多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與斑塊內(nèi)血管新生。血管新生依賴細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用,細(xì)胞外的蛋白水解是血管新生所必需的。因此,在血管新生中,蛋白酶是必不可少的部分,其可促使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及新生血管的形成�；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成過程中可直接降解細(xì)胞外基質(zhì)成分,故受到越來越多的重視。基質(zhì)金屬蛋白酶,是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的鋅依賴性內(nèi)肽酶家族。目前發(fā)現(xiàn)的20多種MMP家族成員根據(jù)其結(jié)構(gòu)和作用底物的特異性可分為四大類：間質(zhì)膠原酶(MMP-1、-8、-13及-18)、明膠酶(MMP-2及-9)、間質(zhì)溶解素(MMP-3、-10及-11)和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-14及-15)。越來越多的研究結(jié)果表明,在血管新生過程中,基質(zhì)金屬蛋白酶不僅參與降解細(xì)胞外基質(zhì),亦可通過多種其他途徑調(diào)節(jié)該過程。MMP-1、-2、-3、-9可促進(jìn)血管新生,部分MMPs也可抑制血管新生。然而,MMPs在AS進(jìn)展期斑塊內(nèi)血管新生中的主要作用仍不明確,有待進(jìn)一步研究。目的：1.建立與人類AS病變特征類似的動(dòng)物模型,觀察兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展期各MMPs表達(dá)的變化趨勢；2.闡明各MMPs在AS進(jìn)展期對(duì)斑塊內(nèi)血管新生及其易損性的影響及可能的作用機(jī)制。方法：1.建立動(dòng)物模型純種新西蘭雄性大白兔(體重1.7-2.1kg)27只給予球囊拉傷術(shù)損傷腹主動(dòng)脈后,高脂飼料(1%膽固醇)喂養(yǎng)。分別在術(shù)后4、6、8、10和12周末隨機(jī)選取5只實(shí)驗(yàn)兔給予安樂死。2.血液生化指標(biāo)的檢測各實(shí)驗(yàn)兔分別于4、6、8、10和12周末處死前留取自凝血,用作生化指標(biāo)的測定。禁食12h,稱取體重后,經(jīng)其耳緣靜脈留取自凝血,采用酶法檢測血清中甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)以及總膽固醇(total cholesterol, TC)的濃度。3.AS易損斑塊的影像學(xué)特征檢查于4、6、8、10和12周末處死動(dòng)物前應(yīng)用血管內(nèi)超聲(IVUS)測量血管外膜彈力膜面積(the external elastic membrane area, EEMA)、管腔面積(lumen area,LA)、斑塊面積(plaque area, PA)及斑塊負(fù)荷(the percentage of plaque burden, PB)等指標(biāo)。4.組織病理學(xué)染色在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉動(dòng)物后,開胸,剪開右心耳,給予生理鹽水灌注。待血液沖洗干凈后,留取球囊損傷處腹主動(dòng)脈標(biāo)本,組織脫水,浸蠟切片。制備厚度為5μm的石蠟切片進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色,同時(shí)進(jìn)行油紅O染色和天狼猩紅染色使脂質(zhì)及膠原顯色。5.免疫組織化學(xué)染色用腹主動(dòng)脈石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢查,用RAM-11和a-actin抗體測定斑塊中巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的表達(dá)分布情況；應(yīng)用MMP-1、-2、-3、-9及-14抗體檢測各MMPs在斑塊內(nèi)的表達(dá)水平；應(yīng)用Ⅰ型膠原(COL-Ⅰ)及Ⅲ型膠原(COL-Ⅲ)抗體檢測斑塊內(nèi)膠原含量；應(yīng)用VEGF抗體檢測斑塊內(nèi)VEGF表達(dá)水平。測量血管內(nèi)膜-中層厚度(intima-media thickness, IMT)。圖片分析使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)。6.毛細(xì)血管密度測定應(yīng)用CD31作為血管內(nèi)皮標(biāo)記物,測定斑塊內(nèi)微血管的密度。7.蛋白表達(dá)水平測定Western Blot):提取腹主動(dòng)脈的組織蛋白進(jìn)行蛋白表達(dá)水平的測定。提取組織蛋白、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗、二抗,而后使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色。檢測組織中MMP-1、-2、-3、-9及-14蛋白表達(dá)水平。用IPP圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)量分析。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±校準(zhǔn)差表示。組間比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)：若方差不齊,使用Dunnett'S T3法進(jìn)行檢驗(yàn)；若方差齊,則使用LSD法進(jìn)行檢驗(yàn)。同時(shí),應(yīng)用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析評(píng)價(jià)易損指數(shù)、微血管密度及VEGF-A與MMPs的相關(guān)性。雙尾P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況所有實(shí)驗(yàn)兔在球囊損傷后均恢復(fù)良好,無并發(fā)癥出現(xiàn)；實(shí)驗(yàn)后期個(gè)別實(shí)驗(yàn)兔狀態(tài)較差,分別于術(shù)后6周及10周各有1只實(shí)驗(yàn)兔死于腹瀉。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重的變化隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展,所有實(shí)驗(yàn)兔體重均逐步增加,各時(shí)間點(diǎn)與上一時(shí)間點(diǎn)相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.血液生化指標(biāo)的檢測隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展,實(shí)驗(yàn)兔血脂各項(xiàng)指標(biāo)均逐漸升高。8周組、10周組及12周組中TC、HDL-C和LDL-C與6周組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),TG則在12周組與6周組相比達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.血管內(nèi)超聲(IVUS)檢查在球囊損傷+高脂飲食后,各組實(shí)驗(yàn)兔LA無明顯差異(P0.05)；10周組和12周組EEMA. PA及PB均較4周組有顯著升高(P0.01),在4周組、6周組及8周組中亦逐漸升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5.病理學(xué)檢查HE染色顯示,血管內(nèi)膜損傷成功后斑塊面積逐漸增大。8周時(shí)斑塊內(nèi)出現(xiàn)少量紅細(xì)胞,提示在球囊損傷腹主動(dòng)脈內(nèi)膜后8周左右斑塊內(nèi)開始出現(xiàn)新生血管。油紅O染色結(jié)果顯示,斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量隨著斑快面積的增加逐步升高。在12周組中明顯高于其他組(P0.01)；10周組與4周組相比,脂質(zhì)含量也明顯增高(P0.05)；4周組、6周組和8周組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。天狼猩紅染色結(jié)果顯示,4周組、6周組、8周組膠原含量無差異；10周組和12周組中膠原含量明顯升高(P0.05)。6.免疫組織化學(xué)染色a-actin染色結(jié)果顯示,平滑肌細(xì)胞含量隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展逐步減少。與4周組相比,其余各組平滑肌細(xì)胞含量均顯著降低(P0.01)；與6周組相比,8周組和10周組平滑肌細(xì)胞含量顯著降低(P0.01)；與10周組相比,12周組平滑肌細(xì)胞含量顯著降低(P0.01)；10周組與8周組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。RAM-11染色結(jié)果顯示,斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量隨著斑塊的發(fā)展逐漸增高。各組與相鄰時(shí)間組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MMPs染色結(jié)果顯示,斑塊中MMP-1、-2、-3及-9含量隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展均顯著升高；而斑塊內(nèi)MMP-14含量則逐漸降低。COL-Ⅰ染色結(jié)果顯示,斑塊中Ⅰ型膠原含量逐漸降低,12周組較4周組Ⅰ型膠原含量降低(P0.05)。斑塊中Ⅲ型膠原含量則隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展逐漸增高。VEGF-A染色結(jié)果顯示,12周組中斑塊內(nèi)VEGF-A含量與4周組相比有所增高(P0.05)。Ⅵ結(jié)果顯示,隨著斑塊的發(fā)展逐漸升高,其易損性逐漸升高,各組之間的易損性差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)IMT隨著斑塊的發(fā)展逐漸升高,說明血管內(nèi)膜損傷成功后高脂喂養(yǎng)可引起斑塊厚度的逐漸增加,各組IMT與上一組相比均顯著升高(均P0.05)。7.毛細(xì)血管密度CD31染色結(jié)果顯示,8周組中斑塊內(nèi)首次觀察到新生血管,隨后斑塊中微血管密度逐漸增加,12周組微血管密度與8周組相比顯著增高(P0.05)。8.蛋白表達(dá)水平檢測(Western Blot)蛋白表達(dá)水平檢測中,各MMPs出現(xiàn)與免疫組織化學(xué)染色中同樣的變化趨勢：MMP-1、-2、-3及-9蛋白表達(dá)量均逐漸升高；MMP-14蛋白表達(dá)量則逐漸降低。9.相關(guān)性分析Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示,MMP-1、-2、-3及-9與易損指數(shù)呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.767,0.809,0.890,0.887,P0.01)；MMP-1、-2、-3及-9與微血管密度(r值分別為0.762,0.813,0.884,0.769,P0.01)和VEGF-A(r值分別為0.760,0.762,0.858,0.789,P0.01)亦均呈顯著正相關(guān)；MMP-14則與易損指數(shù)、微血管密度及VEGF-A均呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.556,-0.424,-0.525,P0.05)；易損指數(shù)與微血管密度呈顯著正相關(guān)(r值為0.846,P0.01)。結(jié)論：1.在AS進(jìn)展期,斑塊內(nèi)MMP-1、-2、-3及-9含量逐漸升高,MMP-14含量逐漸降低；VEGF-A含量逐漸升高；斑塊內(nèi)微血管密度逐漸升高；斑塊易損性逐漸增加。2.在AS進(jìn)展期,斑塊內(nèi)MMP-1、-2、-3、-9上調(diào)和MMP-14下調(diào)與斑塊中微血管密度、斑塊易損性及VEGF-A密切相關(guān),說明在AS進(jìn)展期,MMP-1、-2、-3、-9可能通過上調(diào)VEGF-A的表達(dá)促進(jìn)斑塊內(nèi)血管新生,進(jìn)而導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定。背景：急性心血管事件正在嚴(yán)重威脅人類的健康,其死亡率呈逐年上升趨勢,動(dòng)脈粥樣硬化是急性心血管事件的病理學(xué)基礎(chǔ),不穩(wěn)定斑塊發(fā)破裂從而引發(fā)血栓形成日漸成為急性心血管事件的首要病因。AS是一個(gè)由多種因素共同參與的病理過程,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。近年來,因AS的發(fā)病廣泛且終點(diǎn)事件嚴(yán)重,本病已受到越來越廣泛的關(guān)注,及早防治勢在必行。然而已患病或其他因素引起的AS病人仍普遍存在,且對(duì)AS的治療仍然缺乏有效的措施,故針對(duì)其發(fā)病機(jī)制,應(yīng)用有效而合理的藥物,防止已形成的斑塊發(fā)展為易損斑塊,是預(yù)防由AS斑塊破裂引起的急性心血管事件的根本原則。大量研究結(jié)果表明,斑塊內(nèi)新生血管增多是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損的重要特征之一。在AS斑塊中,新生血管因缺乏完整地基底膜和結(jié)締組織,因此新生的血管多滲透性高且脆性大。斑塊內(nèi)新生血管作為脂質(zhì)持續(xù)進(jìn)入斑塊的主要通道,加速紅細(xì)胞和血液中的脂蛋白易滲出至斑塊內(nèi),加重斑塊內(nèi)脂質(zhì)的形成,導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的硬度降低；也可引起炎癥細(xì)胞滲漏增多,介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的浸潤,從而加速了穩(wěn)定斑塊向不穩(wěn)定斑塊的轉(zhuǎn)化。故斑塊易損性隨著新生血管數(shù)量的增多而增大,在多種因素的作用下,發(fā)生斑塊內(nèi)出血及斑塊破裂。異常的斑塊內(nèi)膜及中膜血管新生被視為易損斑塊的標(biāo)志之一血管新生受多種誘導(dǎo)因子和抑制因子的復(fù)雜調(diào)控,其中涉及多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。首先血管新生依賴細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用,細(xì)胞外蛋白水解可促使基底膜降解,內(nèi)皮細(xì)胞遷移及毛細(xì)血管管腔形成。因此,在血管新生中,蛋白酶是必不可少的部分。MMPs作為四類蛋白水解酶中是最為重要的一組蛋白水解酶,也是目前研究最多的,其幾乎能降解ECM的所有成分,在內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成過程中可直接降解細(xì)胞外基質(zhì)成分,故越來越受到重視。MMP-2及MMP-9都屬于明膠酶,可以降解基底膜膠原及彈性蛋白等,并且具有促使明膠溶解的作用�；啄さ闹饕煞质蔷哂歇�(dú)特的螺旋結(jié)構(gòu)的Ⅳ型膠原,而多數(shù)基質(zhì)蛋白酶無法降解該膠原。MMP-2及MMP-9因可特異性地降解Ⅳ型膠原,并且可以降解層粘連蛋白等基底膜成分,從而破壞基底膜完整性,因此MMP-2及MMP-9與新生血管的形成關(guān)系密切。有研究研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤內(nèi)血管新生中,MMP-2和MMP-9在血管新生中充當(dāng)“開關(guān)”的角色。在前期實(shí)驗(yàn)中,通過對(duì)新西蘭兔腹主動(dòng)脈AS斑塊中MMPs對(duì)斑塊內(nèi)血管新生及斑塊易損性影響的觀察,發(fā)現(xiàn)在AS進(jìn)展期,MMP-2及-9可促進(jìn)斑塊內(nèi)血管新生,進(jìn)而導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein, LRP)是德國學(xué)者Herz于1988年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞表面蛋白。近來有研究表明LRP在AS發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用,并將其視為AS性疾病的又一新的危險(xiǎn)因子。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,LRP1可誘導(dǎo)MMP-2及-9的表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。也有研究發(fā)現(xiàn),LRP1在平滑肌細(xì)胞中可上調(diào)MMP-2的表達(dá),從而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的遷移。中藥具有多途徑、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)等特點(diǎn),可從調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎癥反應(yīng)及抗凝等多個(gè)方面穩(wěn)定AS斑塊,延緩AS進(jìn)程。此外,中藥制劑藥效較為緩和,藥物之間通過配伍而起到減毒增效的作用,副作用小,適宜作為長期二級(jí)預(yù)防用藥。通心絡(luò)是近年來以絡(luò)病理論為基礎(chǔ)、應(yīng)用通絡(luò)藥物治療心血管疾病的代表方藥。該方具有益氣活血,搜風(fēng)通絡(luò)之療效,主要用于治療冠心病、心絞痛中癥屬心氣不足,血瘀阻絡(luò)者。多項(xiàng)研究結(jié)果表明,通心絡(luò)具有穩(wěn)定AS斑塊的作用。本研究以阿托伐他汀作為陽性對(duì)照藥物,應(yīng)用兔腹主動(dòng)脈球囊損傷模型,觀察通心絡(luò)對(duì)斑塊中低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL receptor mlated protein, LRP),磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Phosphorylation-extracellular signal-mgulated kinase, pERK)及MMPs表達(dá)的影響,并初步探討通心絡(luò)影響斑塊中血管新生及斑塊易損性的分子機(jī)制,為AS的防治提供理論參考�；谝陨涎芯�,本課題提出假說：通心絡(luò)可影響AS斑塊內(nèi)血管新生；通心絡(luò)可能通過影響LRP1的表達(dá)進(jìn)而影響MMP-2及-9的表達(dá),抑制斑塊內(nèi)新生血管的形成,從而增加斑塊穩(wěn)定性。目的：1.研究通心絡(luò)在兔腹主動(dòng)脈AS中對(duì)斑塊內(nèi)血管新生及斑塊易損性的影響；2.闡明通心絡(luò)促使斑塊穩(wěn)定可能的作用機(jī)制。方法：1.建立動(dòng)物模型3月齡純種健康雄性新西蘭大白兔(體重1.7-2.1kg)120只,適應(yīng)性喂養(yǎng)2周,給予球囊拉傷術(shù)損傷腹主動(dòng)脈后,高脂飼料(1%膽固醇)喂養(yǎng)12周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵守山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)定和要求。2.動(dòng)物分組及藥物干預(yù)成功建立動(dòng)物模型后隨機(jī)將動(dòng)物分為對(duì)照組,小、中、大劑量通心絡(luò)組,阿托伐他汀組以及聯(lián)合用藥組：A組(對(duì)照組)：20只,成功建立動(dòng)物模型后,給予普通飼料喂養(yǎng)12周；B組(小劑量通心絡(luò)組)：20只,成功建立動(dòng)物模型后,普通飼料+小劑量通心絡(luò)(0.15g/kg/d)喂養(yǎng)12周；C組(中劑量通心絡(luò)組)：20只,成功建立動(dòng)物模型后,普通飼料+中劑量通心絡(luò)(0.3g/kg/d)喂養(yǎng)12周；D組(大劑量通心絡(luò)組)：20只,成功建立動(dòng)物模型后,普通飼料+大劑量通心絡(luò)(0.6g/kg/d)喂養(yǎng)12周；E組(阿托伐他汀組)：20只,成功建立動(dòng)物模型后,普通飼料+大劑量阿托伐他汀(5mg/kg/d)喂養(yǎng)12周；F組(聯(lián)合用藥組)：20只,成功建立動(dòng)物模型后,普通飼料+大劑量通心絡(luò)(0.6g/kg/a)+阿托伐他汀(5mg/kg/d)喂養(yǎng)12周。3.血液生化指標(biāo)的檢測各實(shí)驗(yàn)兔均處死前留取自凝血,用作血液生化指標(biāo)的檢測。禁食12h左右,稱取體重后,經(jīng)其耳緣靜脈留取自凝血,采用酶法檢測血清中甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)以及總膽固醇(total cholesterol, TC)的濃度。4.AS易損斑塊的影像學(xué)特征檢查于處死動(dòng)物前應(yīng)用血管內(nèi)超聲(IVUS)測量血管外膜彈力膜面積(EEMA)、管腔面積(LA)、斑塊面積(PA)、斑塊負(fù)荷(PB)等指標(biāo)。5.組織病理學(xué)染色在麻醉動(dòng)物后,開胸,剪開右心耳,給予生理鹽水灌注。待血液沖洗干凈后,留取球囊損傷處腹主動(dòng)脈標(biāo)本,組織脫水,浸蠟切片。制備厚度為5 μm的石蠟切片進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色,同時(shí)進(jìn)行油紅O染色和天狼猩紅染色使脂質(zhì)及膠原顯色。6.免疫組織化學(xué)染色用腹主動(dòng)脈石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢查,分別應(yīng)用RAM-11和α-actin抗體測定斑塊中巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的表達(dá)分布情況；應(yīng)用MMP-2、-9及抗體檢測MMPs在斑塊內(nèi)的表達(dá)水平；應(yīng)用LRP1、VEGF-A抗體檢測斑塊內(nèi)LRP1、VEGF-A表達(dá)水平。測量血管斑塊纖維帽厚度及血管內(nèi)-中膜厚度(IMT),計(jì)算纖維帽厚度與IMT的比值。圖片分析使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)。7.毛細(xì)血管密度測定應(yīng)用CD31作為血管內(nèi)皮標(biāo)記物,測定斑塊內(nèi)微血管的密度。8.蛋白表達(dá)水平測定(Western Blot):提取腹主動(dòng)脈的組織蛋白檢測各蛋白的表達(dá)水平。提取組織蛋白、檢測蛋白濃度、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗、二抗,而后使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色。檢測組織中MMP-2、-9及LRP1等蛋白表達(dá)水平。用IPP圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)量分析。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±校準(zhǔn)差表示。組間比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)：若方差不齊,使用Dunnett'S T3法進(jìn)行檢驗(yàn)；若方差齊,則使用LSD法進(jìn)行檢驗(yàn)。同時(shí),應(yīng)用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析評(píng)價(jià)易損指數(shù)、微血管密度及VEGF-A與MMPs的相關(guān)性。雙尾P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況所有實(shí)驗(yàn)兔在球囊損傷后均恢復(fù)良好,無并發(fā)癥出現(xiàn)；進(jìn)入藥物干預(yù)階段的實(shí)驗(yàn)兔中,中、大劑量通心絡(luò)組各死亡2只,對(duì)照組、小劑量通心絡(luò)組、阿托伐他汀組及聯(lián)合用藥組各死亡1只,死亡原因分別為呼吸道感染或腹瀉。24周末時(shí)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活情況如下：A組(對(duì)照組)19只,B組(通心絡(luò)小劑量組)19只,C組(通心絡(luò)中劑量組)18只,D組(通心絡(luò)大劑量組)18只,E組(阿托伐他汀組)19只,F組(聯(lián)合用藥組)19只。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重的變化24周末,所有實(shí)驗(yàn)兔體重較實(shí)驗(yàn)開始前均有所增加,但各組之間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.血液生化指標(biāo)的檢測24周末,與A組相比,其余各組血脂TC、TG及LDL-C含量均有所下降,HDL-C含量則均有所升高：與對(duì)照組相比,各藥物治療組血清TC含量均顯著降低(P0.01),聯(lián)合用藥組TC含量降低最為顯著(P0.01),阿托伐他汀組TC含量較通心絡(luò)各組明顯降低(P0.01),通心絡(luò)各組隨劑量增大降TC效果明顯增強(qiáng)(P0.01)；與對(duì)照組相比,各藥物治療組血清TG含量均有明顯下調(diào)(P0.01),聯(lián)合用藥組TG含量下調(diào)較為顯著(P0.01)；大劑量通心絡(luò)組與中劑量通心絡(luò)及阿托伐他汀組TG含量相比均無顯著性差異(P0.05),與小劑量通心絡(luò)組相比則TG含量顯著降低(P0.01)；與對(duì)照組相比,各藥物治療組血清LDL-C含量均有所下調(diào)(P0.01),聯(lián)合用藥組及阿托伐他汀組LDL-C含量降低較為顯著(P0.01),二組之間相比LDL-C含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；通心絡(luò)大劑量組LDL-C水平與通心絡(luò)小劑量組相比顯著降低(P0.01),與中劑量通心絡(luò)組相比無明顯差異(P0.05)；與對(duì)照組相比,各藥物治療組血清HDL-C含量均有所升高,大劑量通心絡(luò)組HDL-C水平明顯高于中、小劑量通心絡(luò)組(P0.05),與阿托伐他汀組相比無顯著差異(P0.05)；聯(lián)合用藥組HDL-C含量較大劑量通心絡(luò)組明顯升高(P0.01),與阿托伐他汀組相比則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.血管內(nèi)超聲(IVUS)檢查造模成功并給予藥物干預(yù)后,與對(duì)照組相比,各藥物干預(yù)組EEMA、PA、 PB均有所降低,各組實(shí)驗(yàn)兔LA則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)：與對(duì)照組相比,阿托伐他汀組及聯(lián)合用藥組EEMA顯著降低(P0.01),通心絡(luò)各組EEMA也有所降低,且隨著劑量的加大其作用更加顯著(P0.01)；與對(duì)照組相比,聯(lián)合用藥組及阿托伐他汀組PA、PB下降均較為顯著(P0.01)；大、中劑量通心絡(luò)組PA、PB均有所下降(P0.01),二組之間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；小劑量通心絡(luò)組與對(duì)照組相比PA、B均無明顯變化(P0.05)。5.病理學(xué)檢查HE染色顯示,造模成功后,各組動(dòng)物腹主動(dòng)脈斑塊明顯,與對(duì)照組相比,各藥物干預(yù)組斑塊面積有所降低。油紅O染色結(jié)果顯示,藥物干預(yù)治療后,各組動(dòng)物斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量均有所下降,C、D、E、 F組脂質(zhì)含量顯著低于A組(P0.01)天狼猩紅染色結(jié)果顯示,對(duì)照組動(dòng)物腹主動(dòng)脈斑塊內(nèi)膠原含量顯著低于阿托伐他汀組和聯(lián)合用藥組,與各劑量通心絡(luò)組相比其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.免疫組織化學(xué)染色a-actin染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,各藥物干預(yù)組動(dòng)物腹主動(dòng)脈斑塊內(nèi)a-actin含量顯著升高(P0.05)。RAM-11染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,各藥物干預(yù)組動(dòng)物腹主動(dòng)脈斑塊內(nèi)RAM--11含量顯著降低(P0.01)。各組腹主動(dòng)脈斑塊內(nèi)均有LRP1、MMP-2及-9、VEGF-A的局部表達(dá)。與對(duì)照組相比,各藥物組LRP1、MMP-2 及-9陽性表達(dá)均顯著降低,其中大劑量通心絡(luò)組、阿托伐他汀組、聯(lián)合用藥組與中、小劑量通心絡(luò)組相比陽性表達(dá)率更低。Ⅵ結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,各藥物干預(yù)組斑塊易損性均顯著降低(P0.01),各劑量通心絡(luò)、阿托伐他汀及聯(lián)合用藥均可降低斑塊易損性,中、小劑量通心絡(luò)組件無顯著性差異(P0.05)。與對(duì)照組相比,各藥物干預(yù)組腹主動(dòng)脈斑塊纖維帽厚度顯著增高(P0.01)；小劑量通心絡(luò)組內(nèi)中膜厚度與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),其余各藥物干預(yù)組IMT均顯著降低(P0.01)；各藥物干預(yù)組腹主動(dòng)脈斑塊纖維帽厚度/IMT比值與對(duì)照組相比均顯著升高(P0.01)。7.毛細(xì)血管密度CD31染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,各藥物干預(yù)組腹主動(dòng)脈斑塊內(nèi)微血管密度均顯著降低(P0.05)。8.蛋白表達(dá)水平檢測Western Blot)蛋白表達(dá)水平檢測中,LRP1、MMP-2、-9出現(xiàn)與免疫組織化學(xué)染色中同樣的變化趨勢：與對(duì)照組相比,LRP1、MMP-2、-9及p-ERK蛋白表達(dá)量在藥物干預(yù)組中均顯著降低,大劑量通心絡(luò)組、阿托伐他汀組、聯(lián)合用藥組與中、小劑量通心絡(luò)組相比陽性表達(dá)率更低。9.相關(guān)性分析Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示,LRP1、p-ERK、MMP-2及MMP-9與易損指數(shù)呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.568,0.789,0.834,0.638,P0.01)；LRP1、p-ERK、MMP-2、MMP-9與微血管密度(r值分別為0.460,0.469,0.516,0.325,P0.01)及VEGF-A(r值分別為0.492,0.625,0.609,0.496,P0.01)亦均呈顯著正相關(guān)；易損指數(shù)與微血管密度呈顯著正相關(guān)(r值為0.424,P0.01)。結(jié)論：1.通心絡(luò)超微粉在兔腹主動(dòng)脈AS中可抑制斑塊內(nèi)血管新生,降低微血管密度降低斑塊易損性；2.通心絡(luò)超微粉在兔腹主動(dòng)脈AS斑塊中可通過抑制LRP1、減少ERK磷酸化、下調(diào)MMP-2和-9的表達(dá),從而抑制斑塊內(nèi)的血管新生、促進(jìn)斑塊穩(wěn)定。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2820876