1、研究背景及目的Wilson病(Wilson's disease,WD)又稱肝豆?fàn)詈俗冃?hepatolenticular degeneration,HLD),是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙性疾病。本病患者由于體內(nèi)銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin,CP)合成障礙以及膽汁銅的排泄障礙,過(guò)量的銅沉積于肝、腦、角膜等臟器組織,引起相應(yīng)臟器功能障礙,臨床以肝損害癥狀、神經(jīng)/精神癥狀、雙眼角膜Kayser-Fleischer環(huán)(K-F環(huán))、腎功能損害為主要表現(xiàn),嚴(yán)重者可危及生命。研究表明,肝臟是WD最先受累的臟器之一,發(fā)病年齡越小,以肝病為唯一表現(xiàn)的可能性越大�；颊哂捎贏TP7B基因突變導(dǎo)致ATP7B功能出現(xiàn)缺陷,不能清除體內(nèi)多余的銅,肝臟、大腦、腎等器官和組織(尤其肝臟和腦組織)中出現(xiàn)大量的銅沉積。體內(nèi)過(guò)多的銅誘導(dǎo)自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),損傷肝細(xì)胞,引起脂肪變性和炎癥,導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡。肝細(xì)胞死亡后將銅釋放入血漿而導(dǎo)致溶血和肝外組織銅沉積,引起受累器官或系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能受損而致病變:如慢性肝炎、肝硬化而導(dǎo)致肝功能衰竭。研究表明,肝細(xì)胞凋亡在所有肝病中均存在,持續(xù)不規(guī)律性肝細(xì)胞凋亡是WD肝損傷的重要原因。最新研究表明,Mi RNA調(diào)控著人類近三分之一的基因,可以轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因表達(dá),細(xì)胞的發(fā)生、分化、增殖、凋亡均受mi RNA調(diào)控。Mi RNA-122在肝臟中特異性高度表達(dá)。Mi RNA通過(guò)靶向調(diào)控凋亡因子直接間接的影響的肝細(xì)胞凋亡進(jìn)程。代謝組學(xué)自誕生以來(lái)在生命科學(xué)多個(gè)領(lǐng)域快速發(fā)展,為研究中醫(yī)藥理論與療效評(píng)價(jià)等關(guān)鍵問題提供了研究方法。肝臟是人體代謝的中心器官,參與機(jī)體合成、分解、轉(zhuǎn)化、排泄。代謝組已經(jīng)在病毒性肝炎、肝硬化、肝癌、肝衰竭中進(jìn)行了相關(guān)的研究。但WD中肝臟的代謝組可能與其它肝病的代謝譜不盡相同,因此WD肝臟的代謝組學(xué)研究對(duì)WD的相關(guān)機(jī)制研究尤為重要。前期對(duì)WD患者的研究中發(fā)現(xiàn),以肝病起病的患者多表現(xiàn)為無(wú)任何臨床癥狀的肝功能異常和肝硬化,甚則以急性肝衰竭起病。導(dǎo)師所領(lǐng)導(dǎo)的課題組在臨床及實(shí)驗(yàn)研究中已經(jīng)證明:中藥復(fù)方肝豆靈可以在促進(jìn)WD患者排銅的同時(shí)保護(hù)肝臟,促進(jìn)肝損傷的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)主要開展以下研究:建立銅負(fù)荷大鼠模型,觀察肝豆靈對(duì)肝組織ALT、AST、TBIL、血清銅、肝銅、肝臟病理的影響,應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡和免疫組化法檢測(cè)了NF-KB、Caspase-3、Bcl-2、Bax的影響,運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)了肝組織中mi RNA-122的表達(dá),進(jìn)一步應(yīng)用代謝組技術(shù)檢測(cè)了肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠肝組織小分子代謝譜的變化,探討肝豆靈治療WD肝損傷的分子機(jī)制。2.方法2.1實(shí)驗(yàn)分為4組:分別為正常組、模型組、青霉胺組、肝豆靈組;2.2按照文獻(xiàn)復(fù)制銅負(fù)荷大鼠模型;2.3使用肝豆靈對(duì)中藥組大鼠進(jìn)行干預(yù),選用青霉胺為陽(yáng)性對(duì)照藥;2.4血清ALT、AST、TBIL由全自動(dòng)生化儀測(cè)定,原子吸收法檢測(cè)血銅、肝銅;2.5應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡,免疫組化法檢測(cè)NF-KB、Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)2.6運(yùn)用RT-PRC法檢測(cè)肝組織中mi RNA-122的表達(dá);2.7應(yīng)用UPLC-MS技術(shù)檢測(cè)WD肝損傷大鼠肝組織小分子代謝譜的變化。3.結(jié)果3.1肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷模型大鼠血清銅和肝銅的影響與正常組比較,模型組血清銅、肝銅含量明顯升高(P0.01),提示銅負(fù)荷大鼠體內(nèi)存在銅蓄積,造模成功;與模型組比較,青霉胺組、肝豆靈組血清銅、肝銅水平顯著降低(P0.01);青霉胺血清銅、肝銅水平低于肝豆靈水平(P0.05)。以上結(jié)果顯示,肝豆靈具有一定的排銅作用,但弱于青霉胺。3.2肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠肝功能的影響各組大鼠肝功能比較:與正常組比較,模型組ALT、AST、TBIL水平顯著升高(P0.01);與模型組比較,青霉胺組和肝豆靈組ALT、AST、TBIL水平顯著降低(P0.01);肝豆靈組ALT、AST和TBIL水平顯著低于青霉胺組(P0.05,或P0.01)。3.3肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠肝組織病理的影響HE染色結(jié)果顯示,正常組大鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞圍繞中央靜脈和匯管區(qū)有序排列,肝細(xì)胞界限明顯,大小基本相同;模型組大鼠肝組織中可見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞界限不清,細(xì)胞核消失、固縮。用藥兩組均較模型組肝損傷程度減輕。3.4肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響正常組未見肝細(xì)胞表達(dá),模型組可見大量凋亡棕褐色肝細(xì)胞表達(dá),各治療組可見棕黃色梭型肝凋亡細(xì)胞的表達(dá),模型組較正常組肝凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多(P0.01),各治療組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組明顯降低,肝豆靈組和青霉胺組相比有差異(P0.05)。3.5肝豆靈對(duì)Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB的影響與正常組相比,模型組可見大量棕褐色或棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),各治療組可見棕褐色或棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常組表達(dá)明顯升高(P0.01),各治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組顯著降低(P0.01),肝豆靈組和青霉胺組相比有差異(P0.05)。3.6各組大鼠肝組織mi RNA-122表達(dá)水平比較與正常組比較,模型組mi RNA-122表達(dá)水平顯著降低(P0.01),與模型組比較,青霉胺組、肝豆靈組mi RNA-122表達(dá)水平顯著升高(P0.05,或P0.01);肝豆靈組mi RNA-122表達(dá)水平顯著高于青霉胺組(P0.05)。3.7肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠代謝組學(xué)的影響模型組中溶血磷脂酰膽堿(20:5、18:2、16:0、18:3、20:1、20:3)、油酸酰胺下降,顯著下降,色氨酸、苯丙氨酸、硬脂酰胺、牛磺酸鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸、�；悄懰犸@著上升。肝豆靈對(duì)提高溶血磷脂酰膽堿(20:5、18:2、16:0、18:3、20:1、20:3)、油酸酰胺的含量,降低色氨酸、苯丙氨酸、硬脂酰胺、牛磺酸鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸、�；悄懰岬暮俊�4.結(jié)論4.1本研究采用銅負(fù)荷法復(fù)制了銅過(guò)量大鼠模型,模型組可見銅過(guò)量后肝損傷病理改變,該模型可反映銅過(guò)量沉積導(dǎo)致肝損傷的病理。4.2本研究發(fā)現(xiàn)銅過(guò)量負(fù)荷大鼠模型可見ALT、AST、TBIL、血清銅和肝銅明顯升高,各治療組均較模型組下降,肝豆靈組ALT、AST、TBIL下降更明顯,青霉胺組血清銅和肝銅低于肝豆靈組,提示肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠有抑制肝損傷作用,排銅效果弱于青霉胺。4.3本研究發(fā)現(xiàn)銅過(guò)量負(fù)荷大鼠模型組凋亡細(xì)胞大量表達(dá),各治療組凋亡細(xì)胞較模型組降低,提示肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠有抗肝細(xì)胞凋亡作用。4.4本研究發(fā)現(xiàn)模型組Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB陽(yáng)性表達(dá),各治療組較模型組明顯改善。提示銅負(fù)荷大鼠肝損傷時(shí)Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB被激活,參與了WD銅負(fù)荷大鼠肝損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。肝豆靈可能通過(guò)對(duì)Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB的抑制作用發(fā)揮了保護(hù)肝臟改善肝損傷作用。4.5本研究發(fā)現(xiàn)模型組mi RNA-122含量明顯降低,各治療組較模型組明顯升高,肝豆靈組升高較模型組明顯。提示銅負(fù)荷大鼠肝損傷時(shí)mi RNA-122可能參與了WD銅負(fù)荷大鼠的肝損傷的發(fā)生發(fā)展,肝豆靈可能通過(guò)升高mi RNA-122發(fā)揮了保護(hù)肝臟改善肝損傷作用,mi RNA-122可作為肝損傷特異性指標(biāo),mi RNA-122可能通過(guò)Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB介導(dǎo)了肝細(xì)胞凋亡。4.6采用UPLC-MS的代謝組學(xué)方法研究了肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠肝損傷大鼠肝組織干預(yù)作用,得到溶血卵磷酯、油酸酰胺、色氨酸、苯丙氨酸、硬脂酰胺、牛磺酸鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸、牛磺膽酸等特征性代謝物,通過(guò)對(duì)這些代謝物的代謝途徑分析發(fā)現(xiàn),銅在肝組織中影響了脂代謝、氨基酸代謝、膽汁酸代謝,而肝豆靈保護(hù)肝臟改善肝損傷可能通過(guò)對(duì)這些代謝途徑的調(diào)節(jié),改善了異常的代謝途徑,體現(xiàn)了中藥復(fù)方治療疾病具有多途徑、多層次、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R285.5


本文編號(hào)：2820410