發(fā)布時間：2020-09-10 18:19

　　 目的：檢測WIF1 (Wnt inhibitory factor 1)在正常早孕期絨毛組織、蛻膜組織的表達和定位；研究WIF1在調控人滋養(yǎng)細胞遷移和侵襲中的作用和可能的機制；探討WIF1在滋養(yǎng)細胞功能調控中的相關信號通路,進一步明確相關分子機制；比較子癇前期和正常胎盤組織中WIF1啟動子甲基化狀態(tài),探討WIF1甲基化在子癇前期發(fā)病中的可能作用機制。方法：(1)免疫組化和Western blotting (WB)檢測人早孕期絨毛和蛻膜組織中WIF1、Wnt5a和P-catenin蛋白的表達。(2)利用慢病毒載體,通過基因過表達和RNA干擾技術,增加和敲除絨毛外滋養(yǎng)細胞HTR8/SVneo和早孕絨毛外植體的WIF1基因表達。(3)采用Western blotting檢測干擾效率。(4)采用Western blotting檢測Cyclin D1表達,碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色檢測細胞周期,MTT實驗檢測細胞增殖。Annexin V-PE/7-AAD染色檢測細胞凋亡。(5)采用Western blotting檢測整合素β1、N-cadherin和E-cadherin的表達。(6)Transwell小室和Matrigel侵襲實驗檢測WIF1對HTR8/SVneo細胞遷移和侵襲能力的調控。(7)明膠酶譜法檢測HTR8/SVneo細胞的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的活性,Western blotting檢測基質金屬蛋白酶組織抑制齊(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)蛋白表達水平。(8)Western blotting檢測WIF1對β-catenin和Wnt5a的表達影響。(9)免疫共沉淀檢測WIF1與Wnt3a和Wnt5a的作用。(10)用重組Wnt5a蛋白培養(yǎng)HTR8/SVneo,采用Western blotting檢測β-catenin、整合素β1、α5和N-cadherin的表達。(11)激光共聚焦顯微鏡檢測重組Wnt5a對滋養(yǎng)細胞鈣離子濃度的影響,進一步明確WIF1調控滋養(yǎng)細胞功能的相關信號通路。(12)運用甲基化特異性PCR(Methylation-specific PCR, MSP)定性分析和亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP)定量檢測比較WIF1在子癇前期和正常胎盤組織中的甲基化狀態(tài),Western blotting檢測DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase, DNMTs)的表達,甲基化抑制劑處理滋養(yǎng)細胞后檢測WIF1的表達,探討WIF1甲基化在子癇前期發(fā)病中的作用及可能機制。結果：(1)WIF1和Wnt5a在合體滋養(yǎng)細胞(syncytiotrophoblast, STB)、滋養(yǎng)細胞柱(trophoblast column, TC)及細胞滋養(yǎng)細胞(cytotrophoblast, CTB)胞漿中均有較高表達；β-catenin在STB、TC及CTB胞漿中均表達,但在CTB中的表達高于其他細胞。WIF1和Wnt5a在母體蛻膜CTB及腺上皮、間質細胞中亦有表達。β-catenin在蛻膜CTB中的表達要高于母體蛻膜細胞。WIF1和Wnt5a在蛻膜組織中的總體蛋白水平高于絨毛組織,而β-catenin在蛻膜中的的總體蛋白水平低于絨毛組織。(2)WIF1促進HTR8/SVneo細胞增殖和凋亡。(3)過表達WIF1抑制HTR8/SVneo細胞和絨毛外植體整合素β1和E-cadherin的表達,促進HTR8/SVneo細胞N-cadherin的表達。(4)過表達WIF1可以通過增加MMPs的活性、抑制TIMPs的表達來促進絨毛外滋養(yǎng)細胞遷移和侵襲能力。(5)WIF1在HTR8/SVneo細胞中直接和Wnt3a和Wnt5a結合,激活β-catenin,促進Wnt5a的表達。(6)重組Wnt5a抑制HTR8/SVneo細胞整合素β1、α5和N-cadherin的表達。(7)重組Wnt5a激活滋養(yǎng)細胞中的鈣信號。(8)WIF1在子癇前期的胎盤組織和正常早期、晚孕期胎盤組織中均有甲基化,但甲基化程度不高,正常足月胎盤組織的甲基化程度比子癇前期的足月胎盤組織和正常早期胎盤組織稍高,但差異并無統計學意義。(9)WIF1的蛋白在子癇前期胎盤組織中的表達存在個體差異,總體水平低于正常胎盤組織,但無顯著性差異。(10)DNMTs在子癇前期胎盤組織中表達均顯著降低。(11)甲基化抑制劑可以顯著提高滋養(yǎng)細胞株JEG3和HTR8/SVneo的WIF1的表達,說明WIF1的表達受甲基化調控。結論：(1)WIF1通過調控MMPs的活性和整合素、鈣黏蛋白和TIMPs的表達影響滋養(yǎng)細胞的侵襲能力,是胎盤發(fā)育過程中的重要調控因子(2)WIF1在滋養(yǎng)細胞中可以激活P-catenin信號,并與Wnt5a相互作用,后者可抑制HTR8/SVneo細胞β-catenin、整合素β1、α5和N-cadherin的表達,說明Wnt信號通路在滋養(yǎng)細胞侵襲中的調控作用。(3) WIF1的表達受甲基化調控。子癇前期胎盤組織中DNMTs表達均顯著降低,WIF1甲基化水平和蛋白表達與正常組織無明顯差異。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R714.244

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本文編號：2816147