脊髓損傷是臨床上較常見的而且非常嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病,常常導(dǎo)致嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)和感覺功能障礙,而且目前臨床上尚無行之有效的治療方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植治療結(jié)合基因療法是當(dāng)前脊髓損傷治療研究的熱點(diǎn)。在脊髓損傷后,神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)修復(fù)中起著非常重要的作用。為了探索一條脊髓損傷治療的新途徑,我們的研究將包含神經(jīng)營養(yǎng)因子-3基因通過慢病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并在用超順磁性氧化鐵顆粒標(biāo)記細(xì)胞后,經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植到體內(nèi),使其在體內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子-3,同時(shí)在移植后,利用磁場的作用靶向傳送移植的干細(xì)胞到病變區(qū),以加速干細(xì)胞向病變區(qū)的趨化運(yùn)動(dòng)的速率和增加干細(xì)胞在病變區(qū)的數(shù)量,從而使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)修復(fù)的作用得到加強(qiáng)、效率得到提高,進(jìn)一步促進(jìn)功能恢復(fù),提高治療效果。同時(shí),我們還能借助MRI觀察移植的磁標(biāo)干細(xì)胞在體內(nèi)的分布。第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、傳代、鑒定目的：使用全骨髓貼壁法分離純化SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,將提取的細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后,并從細(xì)胞的形態(tài)、表面抗原及增值能力方面進(jìn)行鑒定,為實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞來源。方法: 1.采用全骨髓貼壁法分離純化SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并對獲得分離的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),同時(shí)對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。2.用MTT法測定分離的細(xì)胞的生長曲線,對其生長規(guī)律進(jìn)行分析。3.用流式細(xì)胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物(CD29、CD34、CD44、CD45),以鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞是否具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。結(jié)果: 1.經(jīng)全骨髓貼壁法分離純化大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,呈長梭形,在體外可以培養(yǎng)、傳代。2.經(jīng)MTT法測定第3、4、5代細(xì)胞的生長曲線呈S型,且形態(tài)相似,具有較強(qiáng)的增殖能力。3.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的表面標(biāo)記志物,細(xì)胞表面的CD29和CD44表達(dá)呈陽性,CD34和CD45表達(dá)呈陰性,這符合一般骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。結(jié)論： 應(yīng)用全骨髓貼壁法可以分離純化大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,該法操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、提取率高。所獲得的細(xì)胞生長增殖旺盛、可進(jìn)行連續(xù)多次傳代,可以滿足研究使用。第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子-3基因轉(zhuǎn)染和超順磁性氧化鐵顆粒標(biāo)記目的： 利用慢病毒將神經(jīng)營養(yǎng)因子-3轉(zhuǎn)導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,使其能穩(wěn)定表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子-3,同時(shí)用超順磁性氧化鐵顆粒標(biāo)記干細(xì)胞,為脊髓損傷的細(xì)胞移植治療做準(zhǔn)備。方法: 1.首先通過重疊PCR擴(kuò)增att B1-NTF3-att B2,然后利用Gateway技術(shù)構(gòu)建p Down-NTF3,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建包含神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3,NT-3)及紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,Ds Red)基因的質(zhì)粒p LV.EX3d.P/puro-EF1αNTF3IRES/Ds Red Express2,最后進(jìn)行慢病毒包裝。2.利用慢病毒對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染NT3-Ds Red基因。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染NT3-Ds Red基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的NT3 m RNA的表達(dá)。4.Western blotting檢測轉(zhuǎn)染NT3-Ds Red基因后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的NT3蛋白的表達(dá)。5.利用濃度為25μg/ml的超順磁性氧化鐵(Superparamagnetic Iron oxide,SPIO)顆粒標(biāo)記NT3-Ds Red基因轉(zhuǎn)染的鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,然后用普魯士藍(lán)染色檢測細(xì)胞的標(biāo)記率。結(jié)果: 1.構(gòu)建的包含NT3-Ds Red基因的質(zhì)粒p LV.EX3d.P/puro-EF1αNTF3IRES/Ds Red Express2經(jīng)測序檢驗(yàn)完全正確,并能夠成功轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,包裝好的慢病毒滴度約為1.4×108TU/ml。2.成功轉(zhuǎn)染NT3-Ds Red基因后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞熒光顯微鏡下可以觀察到紅色熒光。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測顯示轉(zhuǎn)染NT3-Ds Red基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的NT3 m RNA表達(dá)水平是未轉(zhuǎn)染NT3基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的13倍。4.Western blotting檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染NT3-Ds Red基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以高表達(dá)NT3蛋白,而未轉(zhuǎn)染NT3基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞則不能表達(dá)。5.普魯士藍(lán)染色顯示,濃度為25μg/ml的SPIO成功標(biāo)記轉(zhuǎn)染NT3-Ds Red基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,胞質(zhì)藍(lán)染,胞核呈淡紅色,標(biāo)記率100%。結(jié)論： 構(gòu)建的含NT3-Ds Red基因的慢病毒載體,能夠?qū)T3-Ds Red基因轉(zhuǎn)移并整合入鼠BMSC的DNA中,并使其高效、穩(wěn)定地表達(dá)NT-3因子。同時(shí)濃度為25μg/ml的SPIO能夠有效的標(biāo)記轉(zhuǎn)染NT3-Ds Red基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。為進(jìn)一步的活體實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。第三部分磁靶向NT3基因轉(zhuǎn)染的BMSCs治療大鼠脊髓損傷的療效評價(jià)和核磁共振活體成像目的：經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔途徑將超順磁性氧化鐵(Superparamagnetic Iron oxide,SPIO)標(biāo)記的NT-3基因轉(zhuǎn)染的BMSCs移植入大鼠脊髓損傷模型,然后利用磁場的作用靶向移植的細(xì)胞進(jìn)入脊髓損傷區(qū),并觀察損傷的脊髓組織的修復(fù)和大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況,以評價(jià)治療效果。同時(shí)利用磁共振(magnetic resonance,MR)對移植細(xì)胞進(jìn)行活體成像,以觀察細(xì)胞在體內(nèi)的分布情況。方法: 1.于T10水平行椎板切開術(shù),暴露硬脊膜囊,使用垂直撞擊法建立SD大鼠脊髓損傷模型。2.造模成功7天后,36只大鼠被隨機(jī)分成3組:①BMSCs組,12只,蛛網(wǎng)膜下腔移植轉(zhuǎn)染Ds Red基因的BMSCs;②NT3組,12只,蛛網(wǎng)膜下腔移植SPIO標(biāo)記的轉(zhuǎn)染NT3-Ds Red基因的BMSCs;③M-NT3組,12只,蛛網(wǎng)膜下腔移植SPIO標(biāo)記的轉(zhuǎn)染NT3-Ds Red基因的BMSCs,并在細(xì)胞移植后,于大鼠的背部脊髓損傷水平外置磁鐵24小時(shí)后,移除磁鐵。3.移除磁鐵后,進(jìn)行MR成像,以觀察細(xì)胞在體內(nèi)的分布情況。4.細(xì)胞移植后1、3、7、14、2l、28、35天,參照BBB分級法(Basso,Beattie,Bresnahan locomotor rating scale,BBB)對所有大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評分并記錄。5.各組大鼠急性脊髓損傷模型,于細(xì)胞移植后的第35天,完成運(yùn)動(dòng)功能評分后,所有實(shí)驗(yàn)大鼠被安樂死,獲得損傷的脊髓組織,通過Western blotting檢測脊髓組織NT-3蛋白表達(dá)水平,HE染色觀察損傷脊髓的囊性空洞大小,普魯士藍(lán)染色檢測SPIO標(biāo)記的細(xì)胞,免疫組化染色評估神經(jīng)絲蛋白(neurofilament-200,NF200)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達(dá)。6.所有的數(shù)據(jù)采用均值(x—)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)來表達(dá),BBB評分結(jié)果分析采用重復(fù)測量方差分析,其它數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析,p值小于0.05,認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 6.12和SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果: 1.移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后的急性脊髓損傷的大鼠的MR成像結(jié)果顯示,M-NT3組和NT3組的脊髓損傷處的T2*WI圖像的信號強(qiáng)度明顯下降,其中以M-NT3組下降最多,而BMSCs組未見明顯下降。2.各組急性脊髓損傷的大鼠的BBB評分結(jié)果顯示,在細(xì)胞移植后的第1、3天,各組的BBB評分之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=12,p0.05),但是在細(xì)胞移植治療后的第7、14、21、28、35天,M-NT3組的BBB評分在三組之中最高,而NT3組的BBB評分也明顯高于BMSCs組,這些時(shí)間點(diǎn)的三組的BBB評分經(jīng)重復(fù)測量方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=12,p0.05)。3.在細(xì)胞移植治療后的第35天,各組損傷的脊髓表達(dá)的NT3蛋白的經(jīng)Western Blotting分析顯示,M-NT3組的NT-3蛋白的表達(dá)水平要明顯高于NT3組和BMSCs組,而BMSCs組的NT-3蛋白的表達(dá)水平則明顯低于M-NT3組和NT3組,三組的NT3蛋白表達(dá)水平經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=12,p0.05)。4.在細(xì)胞移植治療后的第35天,各組脊髓損傷區(qū)的普魯士藍(lán)染色顯示,M-NT3組的藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量明顯多于NT3組,而BMSCs組未觀察到任何藍(lán)染細(xì)胞。5.在細(xì)胞移植治療后的第35天,各組損傷的脊髓的HE染色顯示,BMSCs、NT3和M-NT3組脊髓損傷區(qū)囊性空腔面積(x—±SD)分別為:0.64±0.14 mm2、0.51±0.11 mm2、0.39±0.10 mm2,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=12,p0.05)。6.在細(xì)胞移植治療后的第35天,各組損傷的脊髓的免疫熒光染色顯示,三組中,NF200表達(dá)水平在M-NT3組的最高,在BMSCs組最低,而GFAP在M-NT3組的最低,在BMSCs組最高,三組的NF200和GFAP表達(dá)水平分別經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=12,p0.05)。結(jié)論：通過磁靶向移植SPIO標(biāo)記的NT3基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷,不但可以明顯提高細(xì)胞歸巢效率,還能夠明顯減小脊髓損傷區(qū)囊性空腔的面積、促進(jìn)軸突再生、抑制膠質(zhì)瘢痕形成和增進(jìn)功能恢復(fù)。同時(shí),還可以通過磁共振對移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行活體成像,觀察細(xì)胞在體內(nèi)的分布情況。這種脊髓損傷的治療方式是一種高效的、微創(chuàng)的治療方法,非常具有臨床應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R651.2;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2810380