肝臟是人體非常獨(dú)特的免疫器官,它對于接觸到的大量的食物抗原常常誘導(dǎo)免疫耐受而非免疫應(yīng)答。對這些無害抗原的耐受能使機(jī)體減少無謂的免疫反應(yīng),并能保護(hù)機(jī)體免于對外來抗原的免疫攻擊而導(dǎo)致的肝臟炎癥。然而肝臟免疫耐受的特性是一把雙刃劍,在一些嗜肝病毒如乙型肝炎病毒(HBV),丙型肝炎病毒(HCV)的感染下,肝臟常常不能很好地對其進(jìn)行清除,使其在肝臟形成慢性感染并伴隨肝臟炎癥,而這是導(dǎo)致肝臟纖維化、肝硬化甚至肝癌的一個(gè)重要誘因。因此進(jìn)一步對肝臟免疫耐受的機(jī)制進(jìn)行研究并研究如何在慢性病毒感染的情況下打破肝臟免疫耐受是非常必要的。CD8+T細(xì)胞對于清除HBV是至關(guān)重要的,然而在病毒慢性感染的情況下CD8+T細(xì)胞的功能通常處于一種耗竭的狀態(tài),高表達(dá)抑制性分子、低表達(dá)活化性分子,并且產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子IFN-γ, TNF-α的能力也明顯降低,從而導(dǎo)致其不能很好地發(fā)揮抗病毒的作用,使得病毒在機(jī)體中形成持續(xù)感染。多種細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、髓系來源的抑制性細(xì)胞(MDSC)被報(bào)道可以抑制CD8+T細(xì)胞的功能,而清除這些細(xì)胞亞群則可以增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的抗病毒功能并進(jìn)而清除HBV。在本研究中我們深入探索了天然免疫的重要分子Toll樣受體2(TLR2)在HBV介導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞的耗竭中發(fā)揮的作用。在病原體感染及被清除的過程中,會(huì)產(chǎn)生對該病原體特異性的記憶性細(xì)胞,而記憶性細(xì)胞在機(jī)體第二次遇到相同病原體的感染時(shí)能迅速擴(kuò)增、發(fā)揮功能進(jìn)而將該病原體清除。之前的研究一直認(rèn)為具有記憶功能的細(xì)胞主要是獲得性免疫系統(tǒng)的T、B細(xì)胞,而NK細(xì)胞則被認(rèn)為是天然免疫的重要組成部分,它能在病原體感染的早期行使其殺傷功能,但一般不認(rèn)為其具有記憶功能。但最近越來越多的研究表明,NK細(xì)胞也具有獲得性免疫細(xì)胞的特性并且對于特定的抗原和病原體也有記憶性,同樣能夠保護(hù)機(jī)體免于相同病原體再次感染時(shí)所導(dǎo)致的死亡。因此,我們也關(guān)注在HBV被清除的過程中是否有記憶性NK細(xì)胞的產(chǎn)生并且它們是否能夠保護(hù)機(jī)體免于后續(xù)慢性HBV感染導(dǎo)致的持續(xù)攜帶。我將從以下兩個(gè)方面來描述本研究取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Ⅰ.TLR2介導(dǎo)HBV持續(xù)攜帶導(dǎo)致的CD8+T細(xì)胞的耗竭1.TLR2缺陷促進(jìn)HBV的排斥我們采用高壓注射低劑量HBV質(zhì)粒的模型來模擬HBV的持續(xù)攜帶,在該模型中,我們發(fā)現(xiàn)TLR2的缺陷能明顯促進(jìn)小鼠對HBV的排斥,而如果采用TLR2的激動(dòng)劑使TLR2活化,則小鼠血清中HBV表面抗原的含量明顯增高,表明TLR2活化會(huì)導(dǎo)致更為明顯的HBV持續(xù)攜帶。2.TLR2缺陷逆轉(zhuǎn)HBV持續(xù)攜帶導(dǎo)致的CD8+T細(xì)胞的耗竭在HBV持續(xù)攜帶的小鼠中,肝臟CD8+T細(xì)胞呈現(xiàn)出耗竭的狀態(tài)。而在TLR2-/-HBV-carrier小鼠中,肝臟CD8+T細(xì)胞的數(shù)目明顯增多,HBV特異性的CD8+T細(xì)胞的比例明顯上升,并且HBV特異性的CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1的水平明顯降低,另外,CD8+T細(xì)胞表達(dá)較多的活化性分子、較低的抑制性分子,產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子IFN-γ,TNF-α的能力也是明顯增強(qiáng),更為重要的是TLR2-/-HBV-carrier小鼠中功能增強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞在轉(zhuǎn)輸后能幫助受體鼠抵抗HBV的再次感染,也就證明了TLR2缺陷可以逆轉(zhuǎn)HBV持續(xù)攜帶導(dǎo)致的CD8+T細(xì)胞功能的耗竭。3.枯否細(xì)胞通過TLR2依賴的方式誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的耗竭進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn),HBV的注射可以明顯上調(diào)枯否細(xì)胞表面TLR2的表達(dá)。并且與TLR2缺陷類似,枯否細(xì)胞的清除能夠明顯促進(jìn)野生型小鼠對于HBV的排斥,而如果對野生型小鼠和TLR2-/-小鼠均進(jìn)行枯否細(xì)胞的清除,可以發(fā)現(xiàn)原來存在于兩組小鼠間的對HBV排斥能力的差異就消失了,提示我們表達(dá)在枯否細(xì)胞表面的TLR2在維持HBV持續(xù)攜帶的過程中發(fā)揮重要作用。另外,與在TLR2-/-HBV-carrier小鼠中觀察到的現(xiàn)象類似,枯否細(xì)胞清除的HBV-carrier小鼠肝臟CD8+T細(xì)胞的功能也是明顯增強(qiáng)的。因此,枯否細(xì)胞可以通過TLR2依賴的方式誘導(dǎo)HBV的持續(xù)攜帶和CD8+T細(xì)胞功能的耗竭。4.HBV核心抗原(HBcAg)反應(yīng)性的枯否細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素10(IL-10)促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的耗竭HBV質(zhì)粒的注射可以使得枯否細(xì)胞向一種更具抑制性的狀態(tài)轉(zhuǎn)變,而且這種轉(zhuǎn)變是依賴TLR2的�？莘窦�(xì)胞可以通過其表達(dá)的TLR2與HBV核心抗原相互作用產(chǎn)生更多的抑制性細(xì)胞因子IL-10,而IL-10可以直接抑制CD8+T細(xì)胞的功能。在IL-10-/-HBV-carrier小鼠中,CD8+T細(xì)胞的功能得到增強(qiáng),另外HBV特異性的CD8+T細(xì)胞的比例在IL-10-/-HBV-carrier小鼠中明顯上調(diào)。并且HBV-carrier小鼠中枯否細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10可以直接抑制CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力。因此,我們的結(jié)果就表明枯否細(xì)胞可以通過TLR2與HBV核心抗原的相互作用分泌更多的IL-10,進(jìn)而抑制CD8+T細(xì)胞的功能。結(jié)論I：在HBV-carrier小鼠中,枯否細(xì)胞TLR2表達(dá)上調(diào),并且在與HBV核心抗原相互作用后促進(jìn)枯否細(xì)胞產(chǎn)生IL-10,而IL-10可以抑制CD8+T細(xì)胞的功能,導(dǎo)致HBV的持續(xù)攜帶。Ⅱ.HBV清除模型中記憶性NK細(xì)胞的研究1.HBV被清除的過程中NK細(xì)胞得到活化我們采用高壓注射高劑量HBV質(zhì)粒的模型來模擬HBV的清除,發(fā)現(xiàn)在質(zhì)粒注射后NK細(xì)胞的比例無明顯變化,但其活化水平增強(qiáng)。2.HBV質(zhì)粒的注射促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和記憶性分子的表達(dá)我們發(fā)現(xiàn)HBV質(zhì)粒注射后可以明顯促進(jìn)使得NK細(xì)胞先發(fā)生明顯的增殖,而后增殖能力逐漸降低、恢復(fù)到原有水平。并且在HBV質(zhì)粒注射后,NK細(xì)胞表面記憶性分子KLRG1的表達(dá)也是先明顯的上調(diào)而后恢復(fù)到原有水平,與之前報(bào)道的記憶性NK細(xì)胞的表型一致。3.轉(zhuǎn)輸HBV質(zhì)粒致敏的淋巴細(xì)胞能保護(hù)受體鼠免于低劑量HBV質(zhì)粒注射導(dǎo)致的HBV持續(xù)攜帶我們給受體小鼠轉(zhuǎn)輸來自于高壓注射高劑量HBV質(zhì)粒小鼠的淋巴細(xì)胞后再對其進(jìn)行高壓注射低劑量HBV質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)輸?shù)募?xì)胞能幫助受體小鼠排斥HBV質(zhì)粒。4.轉(zhuǎn)輸HBV質(zhì)粒致敏的NK細(xì)胞不能保護(hù)受體鼠免于低劑量HBV質(zhì)粒注射導(dǎo)致的HBV持續(xù)攜帶我們給受體小鼠轉(zhuǎn)輸來自于高壓注射高劑量HBV質(zhì)粒小鼠的NK細(xì)胞后再對其進(jìn)行高壓注射低劑量HBV質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)輸?shù)募?xì)胞不能幫助受體小鼠排斥HBV質(zhì)粒。結(jié)論Ⅱ：在HBV被清除的小鼠中存在記憶樣的NK細(xì)胞,但將其轉(zhuǎn)輸后不能促進(jìn)受體小鼠對于低劑量HBV質(zhì)粒的排斥。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R392

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本文編號：2809130