研究背景：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)發(fā)病率高,其并發(fā)癥嚴(yán)重威脅著人類健康。目前主要治療方法是口服降糖藥物和／或應(yīng)用胰島素等,但患者需要長期甚至終生服藥,藥物副作用大,且不能從根源上解決問題。近年也有成功應(yīng)用造血干細(xì)胞移植、胰島移植治療1型糖尿病的報道,有一定療效,但費(fèi)用高、風(fēng)險大,此外移植患者需長期服用免疫抑制劑。由此可見,研發(fā)一種安全、長效的治療糖尿病及其并發(fā)癥的方法是迫切需要的。研究表明,1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus, T1DM)和2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)均與免疫損傷和炎性反應(yīng)有密切的關(guān)系。因此,有效抑制或阻斷免疫損傷過程應(yīng)具有保護(hù)β細(xì)胞免受損傷、維持胰島功能和糾正胰島素抵抗的功效。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell, MSC)具有強(qiáng)大的免疫抑制作用,特定條件下能夠分化為p樣細(xì)胞,分泌胰島素。另外,MSC具有組織修復(fù)、促進(jìn)血管形成、抗氧化、糾正糖尿病代謝紊亂和胰島素抵抗等功能。由此可見,MSC可在糖尿病發(fā)生的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。MSC來源廣泛,目前骨髓和脂肪組織來源的MSC研究較多,但存在高度病毒污染的可能、隨著年齡增長擴(kuò)增、分化能力下降以及有可能促進(jìn)腫瘤生長等缺點(diǎn),而臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical cord derived mesenchymal stem cell, UMSC)與骨髓、脂肪來源的MSC一樣具有多向分化、支持造血和調(diào)節(jié)免疫等功能,但因其具有來源廣泛、取材方便、不受任何倫理學(xué)限制、分化潛能大、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、病毒感染機(jī)會小、對供者無不良影響、克服了骨髓、脂肪源性MSC的缺點(diǎn),成為可能替代骨髓、脂肪源性MSC的細(xì)胞治療重要來源。本研究建立了UMSC培養(yǎng)體系,并在NCBI Clinical Trial上登記UMSC治療糖尿病的臨床試驗(yàn)(NCT01413035),在此框架基礎(chǔ)上深入研究UMSC治療2型糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的臨床作用及其相關(guān)機(jī)制。該研究成果將對合理應(yīng)用MSC治療糖尿病有重要的指導(dǎo)意義。胰島移植被認(rèn)為是有望治愈DM的方法之一,但由于胰島供體來源的限制、胰島細(xì)胞在體外存活率低以及移植后免疫排斥等問題大大限制了其臨床應(yīng)用。因此,尋求其他來源的胰島素分泌細(xì)胞(Insulin producing cell,IPC)用于替代胰島移植治療DM成為目前的研究熱點(diǎn),此方面研究的突破將有望為治愈DM提供理論依據(jù)和治療手段。干細(xì)胞研究進(jìn)展為探索以干細(xì)胞為種子體外誘導(dǎo)分化生成IPC提供了可能。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell, ESC)是一種全能性的干細(xì)胞,可以分化為IPC,體內(nèi)外發(fā)揮降糖作用,但存在倫理和致瘤性問題；誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cell, IPS)也能在一定條件下分化為IPC,但I(xiàn)PS誘導(dǎo)過程中需病毒轉(zhuǎn)染,病毒載體容易和轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA整合,同樣存在致瘤風(fēng)險；胰腺干細(xì)胞在特定條件下分化為IPC,但胰腺干細(xì)胞來源及表型尚不明確,且其培養(yǎng)非常困難。因此,尋找安全、有效的IPC來源的干細(xì)胞成為解決問題的關(guān)鍵。UMSC不但能分化為IPC,降低糖尿病動物的血糖,而且具有免疫抑制作用,抑制免疫系統(tǒng)對胰島β細(xì)胞的損傷和減輕胰島素抵抗,從而成為IPC的理想來源細(xì)胞,但在目前的技術(shù)手段下,UMSC來源的IPC誘導(dǎo)時間長、分化程度低、體外分泌的胰島素?cái)?shù)量也不能滿足將來大規(guī)模臨床應(yīng)用的需要。由此,如何縮短UMSC向IPC誘導(dǎo)分化時間、提高分化效率以及IPC胰島素分泌功能是解決臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一層粘連蛋白(Laminin)屬于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的一種,具有多種生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn),在人類的胰島,存在著雙層結(jié)構(gòu)不同的基底膜,并檢測到lam in in的存在。Laminin可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞胰島素基因的表達(dá)和胰島素的分泌,其中涉及的主要laminin亞型是laminin 111、laminin 411和laminin 511,這三種laminin都在胰島周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。因此,推測laminin I11、laminin 411和laminin 511可能具有調(diào)控MSC向IPC分化功能。基于如上研究,我們首先優(yōu)化了UMSC向IPC分化體系,然后在分化過程中加入Iaminin411,觀察其對UMSC來源的IPC(UMSC-IPC)分化效率、胰島素分泌功能的影響并探討其作用機(jī)制,為進(jìn)一步提高UMSC向IPC分化效率及IPC胰島素分泌提供理論依據(jù)。本研究分三部分進(jìn)行闡述：第一部分為UMSC輸注對2型糖尿病及其并發(fā)癥的臨床治療作用和相關(guān)機(jī)制研究；第二部分探討laminin 411對UMSC向IPC誘導(dǎo)分化作用及其機(jī)制探討；第三部分為下一步工作計(jì)劃。具體如下：第一部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療2型糖尿病臨床研究目的：研究UMSC治療2型糖尿病及其并發(fā)癥的安全性、臨床療效及其相關(guān)機(jī)制,以期尋找一種安全、長效的治療2型糖尿病及其并發(fā)癥的方法。材料與方法：在獲得山東大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會審批同意后,無菌留取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的臍帶組織,按照UMSC制備標(biāo)準(zhǔn)操作流程分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型和多向分化潛能對所獲細(xì)胞進(jìn)行鑒定。按照入組和剔除標(biāo)準(zhǔn)選取2009.07-2012.10我院收治的18例T2DM患者靜脈輸注UMSC,每次間隔2周,共2-3次,按照療效評價標(biāo)準(zhǔn),比較治療前、治療后第1、3、6月患者的各項(xiàng)指標(biāo)變化,并詳細(xì)記錄所有不良反應(yīng)。綜合數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件分析。結(jié)果：成功獲得符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的UMSC,該細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：呈長梭形纖維樣細(xì)胞,貼壁生長,可以穩(wěn)定傳代；高表達(dá)CD73、CD90、CD105、CD166,低或不表達(dá)HLA-DR、CD34、CD45;具有多向分化的潛能,可以在適宜的條件下,分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。根據(jù)療效評價標(biāo)準(zhǔn),UMSC治療分為有效組和無效組,兩者在臨床基線特征方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；治療有效組患者FBG、PBG均顯著降低(p0.05),血漿C肽水平和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在有效組有升高趨勢,但這兩個參數(shù)的差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。在治療過程中,18例患者中只有4例(22.2%)有輕微的發(fā)熱反應(yīng),無其他不良反應(yīng)。UMSC治療后隨訪6個月,所有患者自覺身體一般情況較前改善,幸福指數(shù)較前提高。結(jié)論：UMSC治療2型糖尿病安全可靠,未見嚴(yán)重不良反應(yīng)。對部分患者,MSC能有效降低空腹和餐后血糖,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Treg生成,抑制異常免疫系統(tǒng)對胰島β細(xì)胞的損傷及改善外周組織對胰島素的敏感性有關(guān)。該研究為進(jìn)一步應(yīng)用UMSC有效治療2型糖尿病奠定了實(shí)踐基礎(chǔ)。第二部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的分化和調(diào)控目的：觀察laminin 411對UMSC向IPC分化效率以及IPC胰島素分泌功能的影響,并探討其作用機(jī)制,為UMSC來源的IPC有效治療糖尿病奠定基礎(chǔ)。材料與方法：UMSC分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定同第一部分。經(jīng)過4個階段將UMSC誘導(dǎo)分化為IPC,通過流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR、Western blot、免疫熒光、DTZ染色及ELISA等檢測方法在細(xì)胞表面分子表達(dá)、mRNA、蛋白水平、是否為胰島β細(xì)胞及胰島素分泌等方面對所誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。在誘導(dǎo)過程中加入laminin 411,首先通過上述實(shí)驗(yàn)方法體外觀察laminin 411對UMSC來源的IPC分化和成熟的影響,并研究其作用機(jī)制；其次,腹腔注射60mg/kg鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)破壞胰島β細(xì)胞建立Wistar大鼠1型糖尿病動物模型,鼠尾靜脈分別輸注UMSC、UMSC誘導(dǎo)的IPC (UMSC-IPC)和添加laminin 411誘導(dǎo)分化的IPC(laminin 411-IPC),通過臨床表現(xiàn)、血糖、C肽、體重、生存分析等指標(biāo),觀察UMSC、UMSC-IPC和laminin 411-IPC對糖尿病大鼠的治療作用。結(jié)果：在成功獲得符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的UMSC的前提下,在胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白(ITS)、尼克酰胺等因子的作用下,經(jīng)過4個階段歷時2周,成功將UMSC誘導(dǎo)分化為IPC,該細(xì)胞具有胰島p細(xì)胞形態(tài),高表達(dá)胰島p細(xì)胞的標(biāo)志物(Pdxl、Insulin),在高糖刺激下胰島素分泌量達(dá)到(189.8±93.05)μIU/ml。在誘導(dǎo)分化過程中,加入laminin 411,IPC的生成量雖無明顯增加,但胰島素分泌量增加3倍以上,達(dá)到(612.1±40.78)μIU/ml；在mRNA和蛋白水平上,laminin 411可以顯著提高IPC Pdx1、Ngn3和insulin mRNA和蛋白的表達(dá)；laminin 411-IPC組決定性內(nèi)皮標(biāo)志物基因SOX17、Foxa2 mRNA表達(dá)較UMSC-IPC組明顯升高(p0.05)；相關(guān)性分析表明,Pdxl和Foxa2 mRNA的表達(dá)量與胰島素的分泌量成正相關(guān)(p0.05)。動物實(shí)驗(yàn)層面,通過腹腔注射STZ成功構(gòu)建了1型糖尿病大鼠模型,laminin 411-IPC組IPC輸注3天后糖尿病大鼠空腹血糖較UMSC-IPC組明顯降低(p0.05)；與UMSC-IPC組比較,laminin 411-IPC組能明顯降低HbAlc的水平(p0.05),而和UMSC組比較,laminin 411-IPC組則能顯著降低HbAlc的水平(p0.01);Laminin 411-IPC組和UMSC-IPC組均能明顯提高糖尿病大鼠生存率和增加體重,但兩組無明顯差異。安全性方面,沒有發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。結(jié)論：UMSC在適當(dāng)條件下能夠誘導(dǎo)生成IPC;Laminin 411能提高UMSC-IPC的分化程度及增強(qiáng)其分泌胰島素的功能,其機(jī)制是通過DE途徑來發(fā)揮作用的；動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),laminin411-IPC能夠有效降低糖尿病大鼠的血糖,改善其臨床癥狀、延長生存期：最重要的是,IPC靜脈輸注是方便、安全可靠的,為將來替代胰腺p細(xì)胞大規(guī)模臨床應(yīng)用治療糖尿病奠定了基礎(chǔ)。 第三部分：下一步的工作1.臨床研究：前期工作中,我們按照入組標(biāo)準(zhǔn)選擇18例2型糖尿病病人,靜脈輸注UMSC,6個月隨訪結(jié)果表明UMSC治療是安全和有效的；對部分患者能夠有效降低血糖、減少降糖藥或胰島素的用量,提高生活質(zhì)量；為進(jìn)一步評價遠(yuǎn)期療效和安全性,我們將對當(dāng)前病例繼續(xù)隨訪觀察。目前臨床病例較少,可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,下一步我們將積極申報國家干細(xì)胞臨床研究基地,大規(guī)模臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證治療效果,并探尋UMSC有效治療糖尿病及其并發(fā)癥的機(jī)制,為UMSC有效治療糖尿病提供理論依據(jù)。2.基礎(chǔ)研究：(1)尋找新型的藥物,提高UMSC向IPC的轉(zhuǎn)化效率及增強(qiáng)其胰島素分泌功能,為體外高效誘導(dǎo)IPC提供新方法,以滿足將來大規(guī)模臨床應(yīng)用；(2)如何降低IPC的免疫原性,避免植入的IPC遭受免疫系統(tǒng)的排斥,是下一步研究的重點(diǎn),欲通過以下方式解決：1)采用UMSC來源的IPC：由于MSC具有低免疫原性,推測其來源的IPC也具有低免疫原性,從而降低機(jī)體免疫系統(tǒng)對其的損傷；2)將UMSC和IPC聯(lián)合移植,觀察能否進(jìn)一步降低機(jī)體免疫系統(tǒng)對IPC的攻擊。3)獲得自體的MSC,應(yīng)用上述方法使其向IPC分化并提高其分化效率和分泌胰島素的功能,徹底解決免疫排斥問題。(3)與胰島移植所面臨的問題一致,IPC移植同樣需要選擇比較理想的移植模式,即細(xì)胞的移植部位和方式是決定IPC移植是否成功的重要環(huán)節(jié),下一步欲比較不同的IPC移植模式(如靜脈、皮下和肌注)對IPC存活及血糖的影響,選擇最優(yōu)的移植模式,有效治療糖尿病。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R587.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Marianna Spanou;Konstantinos Tziomalos;;Bariatric surgery as a treatment option in patients with type 2 diabetes mellitus[J];World Journal of Diabetes;2013年02期

2 Marina Figliuzzi;Barbara Bonandrini;Sara Silvani;Andrea Remuzzi;;WJSC 6~(th) Anniversary Special Issues(2):Mesenchymal stem cells Mesenchymal stem cells help pancreatic islet transplantation to control type 1 diabetes[J];World Journal of Stem Cells;2014年02期

本文編號：2808464