【摘要】：第一章 小鼠脂肪干細胞生物學特性研究背景：干細胞研究在世界范圍內掀起了一股熱潮,因干細胞具有增殖與分化的特性,所以受到越來越多研究者的關注。在諸多成體干細胞的研究中,脂肪干細胞由于其獨特的優(yōu)勢,在組織工程學領域逐漸突顯出來。目的：通過體外分離培養(yǎng)獲得小鼠脂肪干細胞系,了解其生物學特性,并為后續(xù)研究提供實驗材料。方法：以15只成年昆明系小鼠腹部皮下及腹股溝處脂肪組織為材料,Ⅰ型膠原酶37℃條件下消化1h獲得脂肪干細胞。篩選培養(yǎng)體系對脂肪干細胞進行體外培養(yǎng),應用免疫組化鑒定小鼠脂肪干細胞表面標志物,分析小鼠脂肪干細胞體外擴增情況,分析脂肪干細胞在體外培養(yǎng)時的染色體核型變化。結果：15只成年昆明系小鼠,分離獲得12個小鼠脂肪干細胞珠,原代細胞開始培養(yǎng)時,細胞短小,呈圓形或卵圓形,胞體折光度高,24小時后可見培養(yǎng)板有少量細胞貼壁,48小時后貼壁細胞數(shù)量大大增多,待長滿培養(yǎng)板趨于融合時,細胞變得細長呈紡錘形,形態(tài)為長梭形。經(jīng)過120天的培養(yǎng)并對細胞生長情況進行記錄,發(fā)現(xiàn)小鼠脂肪干細胞的生長曲線呈典型的“S”型,PDT分別為42.14hr,46.32hr和43.34hr。細胞增殖過程經(jīng)歷了潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期,說明小鼠脂肪干細胞具有較強的自我更新能力,易于進行體外擴增培養(yǎng)。在體外長期培養(yǎng)時,小鼠脂肪干細胞的衰老水平很低,在25代以內基本沒有明顯衰老現(xiàn)象；在傳至30代時,只有不到5%的細胞表現(xiàn)出衰老現(xiàn)象,傳至35代時也僅有不到15%的細胞表現(xiàn)出衰老現(xiàn)象。脂肪干細胞進行免疫組化鑒定：顯示CD13, CD29, CD44, CD71, CD73, CD90, CD105和CD166呈陽性表達,MAP-2, GFAP和Nestin呈陰性表達。MAP-2, GFAP和Nestin為神經(jīng)相關細胞標志物,說明脂肪干細胞不表達神經(jīng)樣細胞相關蛋白。小鼠脂肪干細胞二倍體染色體數(shù)目為2n=40,包括19對常染色體和1對性染色體,性染色體為X,Y。結論：本實驗所分離的小鼠脂肪干細胞在體外培養(yǎng)條件下擴增能力強,傳代后細胞增殖速度快,細胞形態(tài)良好,衰老水平很低,且未見向神經(jīng)系統(tǒng)分化,為后期神經(jīng)細胞誘導和脊髓損傷修復提供了寶貴實驗材料。第二章 小鼠脂肪干細胞誘導分化為神經(jīng)樣細胞的研究背景：之前相關的研究認為,神經(jīng)細胞在神經(jīng)系統(tǒng)內產(chǎn)生后,很短的時間內就不會在產(chǎn)生新的神經(jīng)細胞。這說明成年動物大腦和脊髓內部的神經(jīng)細胞是呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢,這些神經(jīng)細胞不能夠進行再生和自我更新甚至不能夠替代。后天出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷,例如大腦損傷和脊髓損傷,神經(jīng)系統(tǒng)就不能進行自我替代修復。干細胞來源的神經(jīng)細胞作為新的神經(jīng)細胞供體,為神經(jīng)細胞損傷修復帶來新的曙光。目的：通過體外誘導小鼠脂肪干細胞定向分化為神經(jīng)樣細胞,為脊髓損傷細胞治療提供種子細胞。方法：取第3代培養(yǎng)的小鼠脂肪干細胞,按5×105/mL細胞濃度接種于25 cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。加入含有20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF和2% B27的培養(yǎng)基,放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)進行培養(yǎng)。每隔3天,進行半量更換培養(yǎng)液。于第5-7天時就可以看見有類神經(jīng)樣細胞出現(xiàn),此時進行免疫熒光染色和RT-PCR鑒定分析nestin。之后對細胞進行吹散、離心,于僅含有2% B27的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。誘導分化完成后,進行細胞免疫熒光染色及PCR鑒定。結果：小鼠脂肪干細胞在誘導培養(yǎng)第3-4天,細胞開始向中央聚集,第5-7天可見細胞出現(xiàn)許多小突觸,細胞開始拉絲能并明顯能區(qū)分出胞體和突起,免疫熒光染色和RT-PCR分析nestin陽性。于僅含有2% B27的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)第10天開始,部分呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元樣改變,細胞呈圓形,內可見明顯的細胞核,細胞伸出細長的突起或網(wǎng)狀突起。免疫熒光染色和RT-PCR分析可見細胞可以表達MAP-2和GFAPo細胞誘導培養(yǎng)至第14天時直徑可達100um。結論：在特定的環(huán)境和條件下,小鼠脂肪干細胞可首先分化為神經(jīng)樣細胞,在進一步誘導培養(yǎng)后,可分化成神經(jīng)元和星形膠質細胞。第三章脂肪干細胞治療脊髓損傷及療效評價背景：近年來,各種來源的干細胞已被廣泛用于腦、脊髓、周圍神經(jīng)損傷和其他疾病的治療研究。目前使用干細胞治療主要問題在于細胞來源,倫理、道德、法律的相關問題,腫瘤的發(fā)生、神經(jīng)性疼痛和免疫排斥反應等不良反應。自體來源的脂肪干細胞因其獨特的優(yōu)勢,越來越受到人們的關注。本研究通過使用自體脂肪組織分離的脂肪干細胞定向向神經(jīng)細胞誘導分化,并將誘導獲得的神經(jīng)細胞注射移植到脊髓損傷小鼠模型內,以期使用自體細胞移植治療脊髓損傷,為干細胞治療提供新的理論依據(jù)。目的：通過人為制作小鼠脊髓損傷模型,將前期誘導分化好的神經(jīng)細胞注射移植到損傷模型內,驗證小鼠脂肪干細胞誘導分化的神經(jīng)細胞修復脊髓損傷的能力。方法：首先建立小鼠急性脊髓損傷模型。小鼠用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉。取俯臥位,定位T10節(jié)段,將自制塑料墊片((3mm×3mm)置于T10段脊髓硬脊膜。采用改良Allen's打擊器,完成一次5g×5cm垂直打擊,小鼠尾部痙攣性擺動,雙下肢及軀體回縮撲動,示造模成功。其次進行ADSCs的標記。取生長狀態(tài)良好的ADSCs,加入上述中的誘導液,觀察細胞形態(tài)發(fā)生神經(jīng)樣細胞變化后,利用脂質體包裹攜帶有GFP報告基因的質轉染到誘導后的細胞中。第三ADSCs的移植。脊髓損傷后9d時進行細胞移植治療。麻醉成功后沿原入路切開各層組織,顯露相應損傷脊髓節(jié)段,以脊髓損傷區(qū)域為中心,實驗組用微量注射器移植10μl細胞懸液(1.0×105 cells/μl), PBS對照組注射同體積的PBS,模型對照組不做任何處置。移植完畢后逐層關閉切口。術后常規(guī)護理,從移植前1d至結束全程給予環(huán)孢霉素A(10 mg/kg/d)注射。移植術后4周時用4%多聚甲醛行心臟灌注固定小鼠,取損傷脊髓節(jié)段制作冰凍切片進行檢測。結果：4周后對實驗組和PBS對照組進行免疫組化檢測,實驗組的大鼠細胞能夠聚集填充脊髓損傷區(qū)域,動物脊髓內的神經(jīng)纖維發(fā)生再生,這些神經(jīng)纖維形成網(wǎng)狀與移植的干細胞在脊髓組織內形成交織的網(wǎng)狀結構,將脊髓損傷處的兩端進行連接。PBS對照組沒有出現(xiàn)大量的GFP陽性細胞,脊髓的損傷部位具有較大的空洞,這些空洞呈現(xiàn)囊性。對動物的行為學進行觀察可知,實驗組動物的后肢運動能力和功能恢復顯著好于其他兩組。對其進行BBB評分結果可見,實驗組小鼠BBB的評分結果顯著高于其他兩組的動物評分。SPSS對數(shù)據(jù)進行分析可知,實驗組動物干細胞移植后的不同時期與PBS對照和模型對照組比較都具有顯著差異,且這些差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論：將小鼠脂肪干細胞定向誘導分化為神經(jīng)細胞移植于脊髓損傷處,能在動物的脊髓損傷部位存活生長,甚至對周圍組織能夠重建神經(jīng)環(huán)路,最后對機體功能進行重建和完善。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2
【圖文】：

呈圓形或卵圓形，胞體折光度高，２４小時后可見培養(yǎng)板有少量細逡逑胞貼壁，４８小時后貼壁細胞數(shù)量大大增多，待長滿培養(yǎng)板趨于融合時，細胞變逡逑得細長呈紡錐形，形態(tài)為長梭形（圖２－１）。經(jīng)過１２０天的培養(yǎng)并對細胞生長情況逡逑進行記錄，發(fā)現(xiàn)小鼠ＡＤＳＣｓ的生長曲線呈典型的＂Ｓ＂型。從圖２－２中可Ｗ看出，逡逑不同代次的ＡＤＳＣｓ的生長曲線均呈典型的＾＂形，ＰＤＴ分別為４２．１４ｈｒ，４６．３２ｈｒ逡逑和４３．３４ｈｒ。細胞增殖過程經(jīng)歷了潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期，說明ＡＤＳＣｓ逡逑具有較強的自我更新能力，易于進行體外擴增培養(yǎng)。說明我們分離的小鼠逡逑ＡＤＳＣｓ具有穩(wěn)定的生物學特性，符合體外長期培養(yǎng)及后期的研究工作。逡逑W逡逑圖２－１體外培養(yǎng)的ＡＤＳＣｓ逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＡＤＳＣｓ逡逑２５逡逑

博壬學位論文邐逡逑１．３．３鼠ＡＤＳＣｓ核型分析逡逑鼠ＡＤＳＣｓ二倍體染色體數(shù)目為２ｎ＝４０，包括１９對常染色體和１對性染逡逑色體，性染色體為義Ｙ，雄性為異配ＸＹ，雌性為同配ＸＸ，，染色體大小順逡逑序及特征見圖２－４。這與報道的鼠染色體研究結果基本一致。逡逑

則沒有送兩種基因的表達。Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ結果分析可知（如圖３－３），隨著誘導逡逑時間的延長，神經(jīng)樣細胞標志物也隨之X椉櫻得鞅臼笛櫚撓盞繼跫吞逑凳清義匣竦昧順醪降某曬Αｅ義希牽疲粒繡危危澹螅簦椋鑠危停澹潁紓澹溴義襄義

本文編號：2801229