【摘要】：研究顯示Zeste基因同源物增強(qiáng)子2(enhancer ofzeste homolog 2,EZH2)是果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源物,屬于PcG(Polycomb group)蛋白家族,為表觀遺傳蛋白調(diào)控因子PcG的核心成分之一,具有組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性。眾多研究顯示EZH2在乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。我們的前期工作中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EZH2在膠質(zhì)瘤中高表達(dá),且與膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān),提示EZH2在膠質(zhì)瘤中是潛在促癌分子,但其具體功能及相關(guān)機(jī)制有待闡明。代謝調(diào)控是人體生命活動的基本問題,其狀態(tài)異常與多種重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)�！凹�(xì)胞能量異常(Deregulating Cellular Energetics)”是腫瘤細(xì)胞的特征之一。膠質(zhì)瘤發(fā)生于神經(jīng)外胚層,來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,是具有高度異質(zhì)性的原發(fā)顱內(nèi)腫瘤,具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、病死率高的特點。中樞神經(jīng)系統(tǒng)以葡萄糖為唯一能源,因此胞內(nèi)能量代謝產(chǎn)物及代謝過程的變化尤其是糖代謝異常與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,探索膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖代謝異常的分子機(jī)制對膠質(zhì)瘤的診斷治療相關(guān)研究具有重要意義。在本課題第一部分中,我們首先借助中國膠質(zhì)瘤協(xié)作組(CGGA)數(shù)據(jù)庫,分析PcG相關(guān)基因在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)情況,并在獲得的結(jié)果基礎(chǔ)上逐步細(xì)化差異表達(dá)基因與膠質(zhì)瘤組織級別的相關(guān)性,同時關(guān)注EZH2與患者生存預(yù)后的關(guān)系;隨后,分別使用RNA干擾手段和EZH2抑制劑DZNep下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的EZH2,通過細(xì)胞糖酵解水平檢測(ECAR實驗)評價EZH2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖代謝功能的影響。結(jié)果顯示:EZH2下調(diào)后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞基礎(chǔ)糖酵解水平、最大糖酵解能力和糖酵解儲備量均明顯降低,說明EZH2在有氧糖酵解過程中發(fā)揮重要作用。β-catenin信號通路是腫瘤發(fā)生演進(jìn)過程中的經(jīng)典通路之一,β-catenin已被報道與EZH2存在交互調(diào)控關(guān)系。為了驗證這種交互機(jī)制對上述糖代謝過程的影響,我們引入β-catenin的小分子抑制劑FH535處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)β-catenin活性抑制后膠質(zhì)瘤細(xì)胞基礎(chǔ)糖酵解水平、最大糖酵解能力和糖酵解儲備量均明顯降低,說明β-catenin能夠影響膠質(zhì)瘤代謝,這為ezh2的糖代謝調(diào)節(jié)功能提供了一個可能的效應(yīng)出口。微小rna(micrornas,mirna)近10年來始終是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點。mirna的信號傳遞體系包括多種形式,其本身接受上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子信號,向下游則可通過識別特定的目標(biāo)mrna的3'端非編碼區(qū)域(3'-untranslatedregion,3'-utr),在轉(zhuǎn)錄后水平通過促進(jìn)靶mrna的降解和/或抑制翻譯過程而發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)。隨著系統(tǒng)生物學(xué)研究的開展,mirna的研究也從單一功能走向整體綜合的水平。大量報道證實mirna表達(dá)譜特征與腫瘤的診斷、分期、進(jìn)展、預(yù)后及治療效果存在相關(guān)性,是腫瘤基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要樞紐分子。作為轉(zhuǎn)錄抑制因子,ezh2可沉默下游諸多靶基因,而mirna也是一大類可被ezh2調(diào)控的靶向分子。在本課題第二部分中,我們同樣使用sirna和dnzep兩種處理方法,分別借助mirna表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選ezh2相關(guān)mirna差異譜。結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤細(xì)胞使用si-ezh2處理后有204種mirna表達(dá)上調(diào),59種下調(diào),而使用dnzep處理后有206種mirna上調(diào),22種下調(diào),取兩者交集為ezh2相關(guān)的靶mirna譜,獲得以mir-328、mir-1224-3p和mir-214為代表的85種呈均一趨勢顯著上調(diào)的mirna。結(jié)合生物信息學(xué)靶點預(yù)測,我們構(gòu)建了β-catenin3’-utr區(qū)潛在結(jié)合位點的熒光素酶報告基因質(zhì)粒,雙報告基因檢測驗證β-catenin確實為mir-328、mir-1224-3p和mir-214的直接靶基因,提示mir-328、mir-1224-3p和mir-214可介導(dǎo)ezh2對β-catenin的調(diào)控作用。之后,在cgga數(shù)據(jù)庫同時進(jìn)行mrna芯片和mirna芯片檢測的膠質(zhì)瘤組織樣本數(shù)據(jù)中,我們分析發(fā)現(xiàn)ezh2與mir-328表達(dá)呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,而與mir-1224-3p和mir-214的關(guān)聯(lián)性并不顯著。因此,我們決定選擇以mir-328為例進(jìn)一步探索mirna介導(dǎo)的ezh2作用機(jī)制。表觀遺傳學(xué)指在不改變dna序列的前提下,通過某些機(jī)制引起可遺傳的基因表達(dá)或細(xì)胞表型變化。近年來研究者們逐漸意識到表觀遺傳變異對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后能夠產(chǎn)生重大影響,研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)異常等在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。目前在膠質(zhì)瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DNA甲基化可以導(dǎo)致細(xì)胞周期、凋亡、DNA損傷修復(fù)等過程的多種相關(guān)基因表達(dá)沉默。EZH2是多梳抑制復(fù)合體2(Polycomb repressive complex,PRC2)的核心催化組分,可通過其高度保守的SET區(qū)域?qū)诵◇w組蛋白H3K27進(jìn)行甲基化。約50%的miRNA基因與CpG島有關(guān),其可能被表觀遺傳甲基化抑制。本課題第三部分應(yīng)用亞硫酸鹽處理后測序法檢測miR-328啟動子區(qū)甲基化水平,結(jié)果顯示EZH2下調(diào)后miR-328啟動子區(qū)甲基化水平明顯受抑,隨后結(jié)合染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(CHIP)證實了EZH2與miR-328啟動區(qū)的結(jié)合位點。最后,為了進(jìn)一步驗證EZH2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖代謝的影響是通過miR-328介導(dǎo)所實現(xiàn)的,我們設(shè)計了相應(yīng)的回復(fù)實驗。在對照組和si-EZH2轉(zhuǎn)染組基礎(chǔ)上增加si-EZH2+si-miR-328組,將si-EZH2與si-miR-328共轉(zhuǎn)入細(xì)胞,EACR實驗顯示共轉(zhuǎn)組中ECAR比si-EZH2轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)回復(fù)效應(yīng),且si-EZH2引起的β-catenin表達(dá)下降可被si-miR-328回復(fù),說明si-miR-328可逆轉(zhuǎn)si-EZH2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖代謝的抑制作用,再次證明miR-328是EZH2糖代謝調(diào)控作用的中介分子。綜上所述,本課題綜合運用細(xì)胞功能檢測(ECAR)、高通量篩選(mi RNA芯片)、miRNA/mRNA互作檢測(熒光素酶報告基因)、染色質(zhì)蛋白互作檢測(CHIP)、表觀遺傳學(xué)DNA甲基化分析(MSP)等方法,對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EZH2的功能及機(jī)制進(jìn)行了系列探索。研究發(fā)現(xiàn)EZH2能夠調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖酵解水平,獲得了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的EZH2相關(guān)mi RNA分子譜,并在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中完成了EZH2/miR-328/β-catenin通路的實驗構(gòu)建。這些結(jié)果為后續(xù)深入研究miRNA介導(dǎo)下的EZH2調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ),也為尋找膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后評估的生物靶點和探索膠質(zhì)瘤發(fā)生和演進(jìn)機(jī)制并優(yōu)化治療策略提供了理論參考。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41

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本文編號：2799580