【摘要】：研究背景臨床上,眼科多種疾病的病理改變均為視網(wǎng)膜的供血不足,進(jìn)而造成視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)的損傷及其軸突的損害,并最終以RGCs的凋亡為主要表現(xiàn)。目前臨床對(duì)造成RGCs凋亡的疾病沒有很好的治療方法,迫切需要有效的新方法、新手段。體外培養(yǎng)原代RGCs是研究多種眼科疾病常用的方法,可對(duì)疾病發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和用藥情況、發(fā)生機(jī)制進(jìn)行很好觀察、研究。阿克苷(Acteoside)是一種天然多酚類物質(zhì),屬苯丙素苷類(phenylpropanoid glycosides PPGs),為云南苦丁茶的主要成分,含量達(dá)2.1%。該植物分布于云南東北昭通地區(qū)海拔1000一1500米的亞熱帶闊葉林區(qū),是該地區(qū)的特有經(jīng)濟(jì)作物,物廉價(jià)美。近年來(lái),諸多文獻(xiàn)報(bào)道具有抗氧化活性的天然多酚類物質(zhì)阿克苷,對(duì)于急性缺血性中樞神經(jīng)元損傷、慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)元變性均具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)也有研究報(bào)道在動(dòng)物模型上觀察到阿克苷對(duì)視神經(jīng)夾持損傷的RGCs有保護(hù)作用。為了進(jìn)一步對(duì)阿克苷的視神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行觀察研究,我們進(jìn)行該實(shí)驗(yàn),力求能為臨床帶來(lái)新的治療思路。目的體外RGCs培養(yǎng)模型的建立,以此為依托觀察阿克苷對(duì)RGCs損傷的保護(hù)作用。1、建立正常體外SD大鼠RGCs培養(yǎng)模型2、建立體外低血清培養(yǎng)SD大鼠RGCs損傷模型3、阿克苷對(duì)體外正常培養(yǎng)SD大鼠RGCs安全性觀察4、阿克苷對(duì)低血清所致SD大鼠RGCs損傷的保護(hù)作用觀察方法1、第一部分建立正常體外SD大鼠RGCs培養(yǎng)模型：取材出生1-3天的SD乳鼠16只視網(wǎng)膜組織,經(jīng)0.2%胰蛋白酶(終濃度)消化,制成細(xì)胞混懸液,接種于培養(yǎng)板中,在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng),第72小時(shí)第一次對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行1/3更換,并加入阿糖胞苷(終濃度lOumol/L)抑制雜細(xì)胞,第96小時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)、進(jìn)行Thyl.1特異性熒光染色鑒定并計(jì)數(shù),確定細(xì)胞類別、計(jì)算細(xì)胞純度。2、第二部分低血清培養(yǎng)SD大鼠RGCs損傷模型建立：取用第一部分建立的正常體外RGCs培養(yǎng)模型,設(shè)定6個(gè)血清濃度梯度10%,7.5%,5%,2.5%,1.25%,0%,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。于培養(yǎng)12h、24h對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察,并使用WST-8(cck-8)方法檢測(cè)細(xì)胞活性。3、第三部分阿克苷對(duì)體外原代培養(yǎng)SD大鼠RGCs的安全性觀察：取第一部分建立的正常體外RGCs培養(yǎng)模型,設(shè)定6個(gè)分組——A組(不加藥組)、B組(5mg/ml)、C組(3mg/ml)、D組(1mg/ml)、E組(0.5mg/ml)、F組(PBS組),按照1：50的體積比分別加入常規(guī)培養(yǎng)液、相應(yīng)濃度阿克苷、PBS,在24h、48h分別對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色、計(jì)數(shù)、WST-8(cck-8)方法細(xì)胞活性檢測(cè)。4、第四部分阿克苷對(duì)低血清所致SD大鼠RGCs損傷的保護(hù)作用觀察：取材出生1-3天的SD乳鼠32只,使用第二部分方法12h建立體外低血清RGCs損傷模型；使用第三部分所得1mg/ml阿克苷濃度,加入低血清損傷RGCs模型中,分別在加藥作用12h、36h對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行如下觀察(1)光鏡下形態(tài)學(xué)觀察(2)電鏡下細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察(3)WST-8 (cck-8)方法細(xì)胞活性檢測(cè)(4)免疫組化染色、細(xì)胞計(jì)數(shù)(5)Western Blot免疫印跡法檢測(cè)GAP-43、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1、第一部分取材所制備單細(xì)胞混懸液密度3.0×106/ml,接種當(dāng)時(shí)光鏡下見細(xì)胞單個(gè)、分散、密度均勻；從接種到生長(zhǎng)7天,細(xì)胞都呈正常生長(zhǎng)跡象,軸突長(zhǎng)出、拉絲成網(wǎng)；Thy1.1特異性熒光染色鑒定為RGCs,結(jié)合DAPI核染色計(jì)數(shù),RGCs所占百分率： 92.3%。2、第二部分不同濃度血清培養(yǎng)觀察：(1)不同血清濃度培養(yǎng)12h、24h光鏡下觀察：正常生長(zhǎng)形態(tài)RGCs隨血清濃度降低而減少、細(xì)胞數(shù)量也出現(xiàn)減少趨勢(shì),肉眼可見凋亡形態(tài)；(2)WST-8 (cck-8)細(xì)胞活性檢測(cè)：培養(yǎng)12h和24h時(shí),2.5%,1.25%,0%濃度組細(xì)胞活性降低明顯(p0.05)：而5%、7.5%及10%血清濃度組細(xì)胞活性未見差異(p0.05)。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較,各組細(xì)胞自身比較活性無(wú)差異。3、第三部分按照等體積比(1：50)加用不同濃度阿克苷觀察：(1)免疫組化染色：加藥后24h B組(5mg/ml)細(xì)胞的著色程度較其余組淺;48h B組(5mg/ml)細(xì)胞的密度較其余組低；(2)免疫組化細(xì)胞計(jì)數(shù)：加藥24h,各組間均無(wú)明顯數(shù)量差異(p0.05)；加藥48h,B組(5mg/ml)細(xì)胞減少(p0.05)；(3)WST-8 (cck-8)細(xì)胞活性檢測(cè)：加藥24h和48h,B組(5mg/ml)細(xì)胞活性均減低(p0.05),其余組無(wú)明顯差異(p0.05)。4、第四部分1mg/ml阿克苷按照1：50體積比加入低血清RGCs損傷模型中作用12h、36h(1)光鏡下觀察：不加藥組和PBS組的正常生長(zhǎng)形態(tài)RGCs少見,加藥組RGCs正常形態(tài)明顯、軸突增多；(2)電鏡顯示：不加藥組和PBS組均顯示線粒體空泡、細(xì)胞膜及核膜皺縮不光滑、微細(xì)結(jié)構(gòu)不易觀察到；加藥后隨時(shí)間增加,細(xì)胞膜及核膜的光滑度、完整性改善、胞內(nèi)空泡減少,部分微細(xì)結(jié)構(gòu)明顯；(3)WST-8 (cck-8)細(xì)胞活性檢測(cè)：加藥12h和36h,細(xì)胞活性均有提高(p0.05)；并且,隨用藥時(shí)間增加,細(xì)胞活性增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；(4)免疫組化染色——加藥組細(xì)胞著色較深；免疫組化細(xì)胞計(jì)數(shù)——隨時(shí)間增加,加藥作用使RGCs數(shù)量增加(p0.05);(5) Western Blot免疫印跡法檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量：a. GAP-43相對(duì)表達(dá)量：加藥12h、36h,GAP-43蛋白量都有增加(p0.05)；而且兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較GAP-43的蛋白量也是增加的(p0.05)。b. Bcl-2相對(duì)表達(dá)量：加藥12h、36h,Bcl-2蛋白量都有增加(p0.05)；而且兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較Bcl-2的蛋白量也是增加的(p0.05)。c. Bax相對(duì)表達(dá)量：加藥12h、36h,Bax蛋白量都有下降(p0.05)；而且兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較Bax的蛋白量也是下降的(p0.05)。d. Bcl-2/Bax值：12h時(shí)間組,不加藥組為0.964979,加藥組為2.061404,加藥組／不加藥=2.14；36h時(shí)間組,不加藥組0.977391、加藥組4.052812,加藥組／不加藥組=4.15。加藥組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),Bcl-2/Bax值均大于1,并隨時(shí)間增加而增加,反映Bcl-2的相對(duì)量超過(guò)Bax,提示細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗性增強(qiáng)。結(jié)論1、Thy1.1特異性鑒定表明培養(yǎng)細(xì)胞為RGCs,結(jié)合DAPI染色計(jì)數(shù)顯示RGCs占比率為92.3%,體外培養(yǎng)RGCs模型成立。2、通過(guò)利用改變完全培養(yǎng)基的配液成分,模擬細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的變化,經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞活性的檢測(cè),確認(rèn)1.25%胎牛血清培養(yǎng)12h,低血清培養(yǎng)RGCs的損傷模型成立。3、通過(guò)對(duì)RGCs活性及數(shù)量的測(cè)定,最終確立加入體積比1：50時(shí),0.5mg/ml、 lmg/ml、3mg/ml的阿克苷濃度是具有安全性的。4、通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、微細(xì)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞活性、免疫組化染色計(jì)數(shù)觀察,以及GAP-43、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量的檢測(cè)、Bcl-2/Bax比值的變化來(lái)看,幾方面的結(jié)果都相互符合,具有一致性,證明阿克苷在低血清造成的RGCs損傷模型中對(duì)RGCs具有保護(hù)作用,不僅對(duì)軸突的再生起到作用、對(duì)細(xì)胞的對(duì)抗凋亡的抵抗性也有增強(qiáng)。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R774.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2793331