【摘要】：前言近年來,隨著外科學(xué)迅速的發(fā)展,全身麻醉的比例逐漸增高,它能夠保證不同種類的手術(shù)能夠得到無痛以及較為安全舒適的操作條件。雖然全身麻醉已經(jīng)經(jīng)歷了接近兩個(gè)世紀(jì),但其具體作用機(jī)理仍然無明確的解釋。隨著外科手術(shù)量的增加,術(shù)后認(rèn)知功能障礙等一些相關(guān)麻醉并發(fā)癥逐年增加,有關(guān)麻醉藥物對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)問題,尤其是全身麻醉藥物是否會(huì)影響嬰幼兒、兒童將來學(xué)習(xí)以及記憶功能這一問題得到了全球麻醉及外科醫(yī)生的普遍關(guān)注。七氟醚因其誘導(dǎo)及蘇醒快,對(duì)肝腎功能以及血流動(dòng)力學(xué)影響小等優(yōu)點(diǎn),目前在臨床上應(yīng)用較廣泛。有研究認(rèn)為,七氟醚可能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng),還能引發(fā)氧化應(yīng)激以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)失衡,進(jìn)而對(duì)大鼠的認(rèn)知功能產(chǎn)生影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,無論是靜脈藥物還是吸入藥物都能引發(fā)中樞神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,尤其是在大腦組織發(fā)育的關(guān)鍵階段,麻醉藥物對(duì)中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建產(chǎn)生影響,使今后的學(xué)習(xí)以及記憶功能受到損害。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn),異氟醚除了能增加中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡,還能夠抑制祖細(xì)胞增殖,因而可降低新生動(dòng)物今后的學(xué)習(xí)及記憶能力。有一項(xiàng)最近的研究發(fā)現(xiàn),早期的麻醉能夠增加兒童患學(xué)習(xí)障礙的風(fēng)險(xiǎn)。另外一項(xiàng)研究表明小于兩歲的與大于兩歲的兒童相比,麻醉后患有成年后行為異常的風(fēng)險(xiǎn)增加。這些研究暗示了麻醉神經(jīng)毒性作用可能是兒童發(fā)展為學(xué)習(xí)障礙和成年后行為異常的危險(xiǎn)因素。有臨床前期實(shí)驗(yàn)闡述了七氟醚全麻對(duì)于發(fā)育中大腦的神經(jīng)毒性作用與神經(jīng)元凋亡和隨之的認(rèn)知功能障礙相關(guān)。因此,能夠?qū)股窠?jīng)元凋亡的治療方法可能減輕七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)認(rèn)知功能損害。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,鞘磷脂尤其是神經(jīng)鞘磷脂是少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘的基本組成成分。神經(jīng)鞘磷脂可以被酶催化形成神經(jīng)酰胺,后者可以被神經(jīng)酰胺酶進(jìn)一步催化形成鞘氨醇,鞘氨醇可以被鞘氨醇激酶(sphingosine kinases, SphK)磷酸化而形成1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)。SIP的信號(hào)傳輸路徑能夠刺激神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活。有報(bào)道稱S1P能促進(jìn)PC12細(xì)胞和人工培養(yǎng)的腦神經(jīng)元存活。細(xì)胞內(nèi)S1P水平增加可以抑制PC12細(xì)胞由于外源性神經(jīng)氨酸的添加或者漿液缺乏導(dǎo)致的凋亡。而且,最近的一項(xiàng)研究表明,鞘氨酸激酶1/S1P信號(hào)傳遞的缺乏能夠破壞神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活,并破壞神經(jīng)祖細(xì)胞在感覺神經(jīng)節(jié)的發(fā)育過程。FTY720是一種較為新型的免疫抑制劑,它是從冬蟲夏草的培養(yǎng)液中提取出具備免疫抑制作用的成分,再進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造而成。它的免疫抑制作用不同于傳統(tǒng)的淋巴細(xì)胞激活信號(hào)機(jī)制,而主要是通過對(duì)淋巴細(xì)胞定居和遷徙發(fā)揮作用。FTY720是磷酸鞘氨酸(S1P)受體激動(dòng)劑,最近報(bào)道它能夠提高大鼠或大鼠模型腦缺血、腦出血以及缺血性卒中、急性脊髓損傷的神經(jīng)產(chǎn)物,進(jìn)而顯著促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。我們本研究的目的是FTY720所產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)是否能夠?qū)蛊叻岩l(fā)的神經(jīng)毒性。研究方法1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所有的實(shí)驗(yàn)程序都獲得山東省立醫(yī)院動(dòng)物常務(wù)委員會(huì)批準(zhǔn),120只7天齡SD大鼠從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院獲得,動(dòng)物可以自由飲水進(jìn)食,并提供12小時(shí)晝夜循環(huán)。2.初級(jí)海馬神經(jīng)元的準(zhǔn)備海馬神經(jīng)元是由18天大鼠制取,海馬組織從頭部解剖,神經(jīng)元通過胰蛋白酶和研磨來分離。神經(jīng)元被保存在37。C含5%CO2和95%空氣潮濕環(huán)境的無血漿B27母細(xì)胞介質(zhì)中。神經(jīng)元是經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)7天采用抗-MAP抗體提純。3.麻醉暴露神經(jīng)元在4×105/ml密度的六孔盤中培養(yǎng)。大鼠幼崽在一個(gè)37。C的密閉空間內(nèi)接觸七氟醚,七氟醚由一個(gè)固定口徑的噴霧器向空間內(nèi)傳送。接觸氣體包括七氟醚混合了3%的C02、21%的02和平衡N2�；铙w實(shí)驗(yàn)是采用出生后7天的大鼠幼崽。隨機(jī)分成5組(n=24每組)。對(duì)照組暴露在5%C0221%02和平衡N2混合氣體中6小時(shí).其他四組的所有大鼠注射溶劑(DMSO)、FTY720 (1mg/Kg), FTY720和MEK抑制劑(U0126 10mg/Kg),或者FTY720和VPC20319 (0.5mg/Kg)。均暴露于2.1%的七氟醚5%C0221%02和平衡N2混合氣體中6小時(shí)。我們選擇2.1%的七氟醚濃度是與臨床相關(guān)的大鼠不能致死的濃度。氣體以2L/min速度吹入大鼠的環(huán)境中。七氟醚暴露后,每組中12只大鼠立即被實(shí)施安樂死,采集海馬組織做免疫印跡分析。其他大鼠繼續(xù)生長(zhǎng)至35天用作神經(jīng)認(rèn)知評(píng)估。4.免疫印跡分析正如前面描述的海馬組織和神經(jīng)元培養(yǎng)為免疫印跡做準(zhǔn)備。神經(jīng)元培養(yǎng)和海馬組織的溶解產(chǎn)物以12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺瓊脂電泳分離,然后進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜。初級(jí)抗體為抗ERKl/2抗體以及抗Bax抗體和抗Bcl-2抗體,隨后用辣根過氧化酶標(biāo)記的二級(jí)抗體孵育并顯色分析。5.細(xì)胞凋亡分析細(xì)胞凋亡的檢測(cè)采用FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)凋亡試劑盒進(jìn)行。細(xì)胞用冰的磷酸鹽緩沖劑洗脫,然后以1×106cell/ml的濃度以緩沖液混懸。細(xì)胞采用膜聯(lián)蛋白v-FITC和Propidium iodide在黑暗環(huán)境中染色15分鐘后以流式細(xì)胞儀分析。Annexin V-FITC陽性且Propidium iodide陰性的細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。6.神經(jīng)損傷的評(píng)估曠場(chǎng)試驗(yàn)是用來評(píng)估一般運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、探索習(xí)慣和前面提到的焦慮。大鼠幼崽被暴露于七氟醚中,然后置于曠場(chǎng)中,觀察大鼠在一定時(shí)間內(nèi)所通過區(qū)域數(shù)值。物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是用兩組新事物識(shí)別任務(wù)來評(píng)估,大鼠幼崽在接觸七氟醚之前,先在盒子中用兩個(gè)識(shí)別物體來預(yù)檢測(cè)建立基線。七氟醚暴露后,將大鼠幼崽放在盒子里,允許它們探索兩個(gè)放置在一定距離的識(shí)別物體三分鐘。它們被移入盒子兩小時(shí)后將其中一個(gè)熟悉的物體換成不同形狀和外觀再重新測(cè)試。探索所有物體的時(shí)間被記錄。數(shù)據(jù)用大鼠幼崽探索新物體與熟悉物體時(shí)間百分比來表示。研究結(jié)果].七氟醚是以一種時(shí)間依賴性方式誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。神經(jīng)元凋亡在七氟醚暴露3,6,9小時(shí)后采用流式細(xì)胞儀評(píng)估。與對(duì)照組相比神經(jīng)元凋亡隨時(shí)間增長(zhǎng)。神經(jīng)元凋亡數(shù)分別是11.4±0.5%,24.9±1.9%,28.2±2.3%。相反,對(duì)照組暴露于混合氣體組9小時(shí)后凋亡率無明顯變化。2.FTY720減輕體外實(shí)驗(yàn)七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡。為了闡述FTY720對(duì)于七氟醚誘發(fā)神經(jīng)元凋亡的保護(hù)效應(yīng),細(xì)胞在暴露七氟醚時(shí)用不同濃度的FTY720培養(yǎng)。之前的研究表明超生理微摩爾濃度的FTY720致大鼠小腦神經(jīng)元凋亡。此外,一項(xiàng)早期臨床前期動(dòng)物模型研究報(bào)道0.14μM濃度的FTY720才具有治療作用。因此,在我們的實(shí)驗(yàn)中,我們檢測(cè)5-10nM的FTY720對(duì)神經(jīng)元的凋亡效應(yīng)。結(jié)果表明,10nM濃度的FTY720能有效保護(hù)神經(jīng)元對(duì)抗七氟醚的促凋亡作用。(17.2±1.3%,P0.05,七氟醚暴露6小時(shí))。應(yīng)用FTY720 50和100nM濃度,凋亡細(xì)胞降低到8.9±1.1%和6.1±0.7%。3.FTY720激活的S1P受體能夠預(yù)防體外實(shí)驗(yàn)七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡當(dāng)FTY720被2型SPHK轉(zhuǎn)化成磷酸鹽時(shí),在毫微摩爾濃度下,便具備了S1P1、S1P3、S1P4、S1P5的全激動(dòng)劑功能。為了驗(yàn)證這一假設(shè)FTY720主要擔(dān)當(dāng)神經(jīng)元中S1P1激動(dòng)劑的這一假設(shè),我們檢測(cè)了選擇性S1P1激動(dòng)劑SEW2871和S1P1拮抗劑VPC23019對(duì)于七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用,0.5μM的SEW2871與50nnM的FTY720具有相似的神經(jīng)保護(hù)作用。反之,0.5μM的VPC23019能夠消除FTY720的神經(jīng)保護(hù)作用�？傊�,這些結(jié)果表明FTY720對(duì)于S1Pl的激活能夠阻礙七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)凋亡。4.FTY720通過使ERKl/2磷酸化來防止神經(jīng)元凋亡新的證據(jù)表明通過S1P1受體的存活信號(hào)與ERK1相關(guān)。因此,我們測(cè)試FTY720是否能夠通過激活ERK1/2發(fā)揮抗凋亡作用。當(dāng)培養(yǎng)的神經(jīng)元暴露于七氟醚中時(shí),暴露組與對(duì)照組相比磷酸化的ERK1/2顯著降低,然而,FTY720組的磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)水平能夠顯著維持。此外,VPC23019處理能夠消除暴露于七氟醚下的FTY720對(duì)于p-ERK1/2水平的維持作用,表明FTY720通過結(jié)合S1P1受體來激活ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)。為了進(jìn)一步明確ERK1/2在FTY720神經(jīng)保護(hù)中的作用,在神經(jīng)元暴露于七氟醚時(shí)用FTY720和MEK抑制劑(U0126,5μM)處理,FTY720的抗凋亡作用被U0126消除,這些數(shù)據(jù)表明,FTY720通過S1P1依賴的ERK1/2路徑激活來保護(hù)神經(jīng)元對(duì)抗七氟醚誘導(dǎo)的凋亡。5.FTY720通過調(diào)節(jié)Bcl2/Bax比例來減弱七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。麻醉劑誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡對(duì)麻醉劑神經(jīng)毒性其重要作用。為了檢驗(yàn)Bcl-2/Bax比例的調(diào)節(jié)是否是FTY720對(duì)抗七氟醚誘發(fā)神經(jīng)凋亡的基礎(chǔ),我們檢測(cè)Bcl-2,Bax細(xì)胞凋亡蛋白的水平。我們的結(jié)果表明七氟醚暴露能明顯降低Bcl-2/Bax比例,導(dǎo)致斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3水平升高。相反,FTY720升高和Bel-2/Bax比例的降低,能夠使七氟醚處理過的神經(jīng)元中的斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3減少。此外,我們發(fā)現(xiàn),加入VPC23019或U0125能夠逆轉(zhuǎn)FTY720對(duì)于暴露七氟醚的神經(jīng)元的調(diào)節(jié)效應(yīng)�？偠灾�,FTY720通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例來防止七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)凋亡。Bcl-2/Bax比例調(diào)節(jié)是通過S1P1依賴的ERKl/2激活來完成。6.FTY720能夠減輕七氟醚暴露引起的神經(jīng)損傷FTY720的神經(jīng)保護(hù)作用采用大鼠幼崽做測(cè)試,有報(bào)道稱給予大鼠0.1 ～1mg/kg的FTY720時(shí),血漿濃度低于1ng/ml,給予1mg/kg是安全的。因此,大鼠幼患在暴露七氟醚之前注射媒介物(DMSO)或1mg/kgFTY720, FTY720和MEK抑制劑(U0126,1mg/kg)或FTY720和VPC23019 (0.5mg/kg)。盡管七氟醚加媒介組大鼠活動(dòng)距離輕微降低,但與其他組比無顯著差異,表明大鼠沒有情緒抑制及運(yùn)動(dòng)功能障礙,反之,應(yīng)用兩個(gè)物體間的識(shí)別任務(wù)實(shí)驗(yàn)來測(cè)試學(xué)習(xí)和識(shí)別記憶。七氟醚加媒介組的大鼠幼崽在探索新物體時(shí)花費(fèi)了更多的時(shí)間,然而七氟醚加FTY720組與對(duì)照組花費(fèi)時(shí)間相似,表明FTY720可以降低七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)認(rèn)知損傷。我們同時(shí)觀察到共同應(yīng)用U0126和VPC23019能夠消除FTY720對(duì)于七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)毒性的神經(jīng)保護(hù)作用。7.FTY720通過抑制七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡來提高神經(jīng)產(chǎn)物。為了進(jìn)一步明確FTY720通過防止神經(jīng)元凋亡來保護(hù)大鼠幼崽對(duì)抗七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)毒性,我們采用免疫印跡分析法檢測(cè)凋亡分子與體外試驗(yàn)相似,注射了FTY720的大鼠神經(jīng)元凋亡數(shù)少于只注射媒介組。由斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3水平的降低可以證明,此外,向大鼠體內(nèi)注射FTY720的同時(shí)注射U0126或VPC23019,斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3水平升高,出現(xiàn)了與活體實(shí)驗(yàn)一致的神經(jīng)保護(hù)作用。在活體內(nèi)FTY720對(duì)于Bcl-2, Bax和ERK1/2的調(diào)節(jié)效應(yīng)也被檢測(cè)到,表明了在活體內(nèi)FTY720通過SlP1依賴的ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)路激活來調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例。研究結(jié)論通過我們的研究,可以與既往的研究相互印證,證實(shí)七氟醚可以誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,并可以導(dǎo)致大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的損傷,導(dǎo)致認(rèn)知與學(xué)習(xí)能力的降低,但是對(duì)于深層次的情緒方面如焦慮并沒有明顯影響。FTY720對(duì)七氟醚導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡以及大鼠神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)的損傷具有保護(hù)作用,可以消除七氟醚所誘導(dǎo)的凋亡以及減輕七氟醚導(dǎo)致的大鼠認(rèn)知能力降低。通過對(duì)S1P傳導(dǎo)通路進(jìn)一步細(xì)化的研究表明,FTY720的這種保護(hù)作用是通過作為S1P受體激動(dòng)劑而作用于S1P信號(hào)傳導(dǎo)通路來起作用,具體作用位點(diǎn)應(yīng)當(dāng)作用于ERK1/2磷酸化和調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例來防止神經(jīng)元凋亡、減輕神經(jīng)系統(tǒng)毒性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R614

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本文編號(hào)：2795591