【摘要】：研究背景和目的:HIV-1反式激活因子Tat對HIV的復(fù)制至關(guān)重要,也是導(dǎo)致HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能紊亂(HIV-associated neurocognitive disorder,HAND)的重要神經(jīng)毒性因子�？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療不能有效抑制腦內(nèi)HIV的復(fù)制,且不能阻止病毒早期蛋白尤其是Tat的產(chǎn)生,尚不能徹底治愈HAND。HIV感染一旦建立,腦內(nèi)的HIV感染的巨噬細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞可不斷釋放Tat至細(xì)胞外,由此產(chǎn)生直接和間接的神經(jīng)毒性。因此,設(shè)法在腦內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的抗Tat抗體將可中和Tat,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本研究將構(gòu)建人源化抗Tat單鏈抗體-Fc融合蛋白Hutat2:Fc,通過慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至人單核細(xì)胞系、神經(jīng)細(xì)胞系和原代人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞(human monocyte-derived macrophages,hMDM),觀察其在不同細(xì)胞中的表達(dá)情況,并評價(jià)Hutat2:Fc融合蛋白的生理學(xué)功能及潛在的副作用。單核/巨噬細(xì)胞可自由的通過血腦屏障(blood-brain barrier,BBB),是較為理想的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物或基因遞送載體,以此為載體的治療方法的建立需要很好的了解體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞在炎癥情況下經(jīng)外周循環(huán)向腦內(nèi)遷徙效率。故本研究還將對大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的腦炎情況下小鼠骨髓源性單核細(xì)胞(bonemarrowderivedmonocytes,bmdm)向腦內(nèi)遷徙的規(guī)律和特點(diǎn)進(jìn)行初步觀察。方法:將構(gòu)建的融合了人igg1引導(dǎo)序列、人源化抗-tat單鏈抗體hutat2、人igg3fc段的重組基因片段(hutat2:fc)連入tat基因敲除的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒骨架phr-hb7-ires-egfp,與pcmv-Δr8.2、pcmv-vsv-g共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞制備重組慢病毒載體hr-hutat2。用重組慢病毒載體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)人神經(jīng)細(xì)胞系htb-11、單核細(xì)胞系u937和hmdm,通過免疫熒光染色、qrt-pcr、westernblot法和elisa檢測細(xì)胞重組融合蛋白hutat2:fc的表達(dá)和分泌。通過免疫斑點(diǎn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)和westernblot法體外檢測hutat2:fc與tat的結(jié)合作用,通過細(xì)胞活力和細(xì)胞相對存活率檢測評價(jià)hutat2:fc對tat誘導(dǎo)的htb-11和原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元毒性的保護(hù)作用,通過p24定量來評價(jià)hutat2:fc對hiv-1感染的hmdm的病毒抑制作用。通過對細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)、qrt-pcr對15個(gè)hmdm功能相關(guān)基因表達(dá)的檢測,及對hmdm分泌的il1β、il8、il10和tnf-α的檢測來評價(jià)慢病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的潛在的副作用。用lps小鼠腦炎模型評價(jià)經(jīng)鼠尾靜脈輸注的超順磁性氧化鐵(superparamagneticironoxide,spio)標(biāo)記的外源性小鼠bmdm和gfp轉(zhuǎn)基因小鼠bmdm向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷徙的特點(diǎn)和分布規(guī)律。結(jié)果:慢病毒載體可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系和hmdm(轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分別為99%,95%和53%)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可長期、穩(wěn)定的表達(dá)目的蛋白。在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中均可檢測到正確形式的hutat2:fc融合蛋白,hutat2:fc融合蛋白可在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中累積至高濃度。hutat2:fc可體外結(jié)合hiv-1tat,拮抗tat對htb-11細(xì)胞系和原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的毒性作用。分泌的hutat2:fc和hr-hutat2轉(zhuǎn)導(dǎo)的hmdm可顯著抑制hiv-1bal感染的人巨噬細(xì)胞p24的表達(dá)及hiv-1誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)。慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞活力無顯著影響。15個(gè)檢測基因中,轉(zhuǎn)導(dǎo)的hmdm的il8、stat1和ido1基因表達(dá)上調(diào),但并未觀察到這些基因表達(dá)上調(diào)對hutat2:fc的神經(jīng)保護(hù)作用的影響。體外培養(yǎng)的小鼠bmdm細(xì)胞可遷徙入lps誘導(dǎo)的腦炎小鼠患側(cè)大腦,在移植后第2天數(shù)目達(dá)到高峰,隨后逐漸聚集在炎性部位周圍,進(jìn)入腦內(nèi)的單核細(xì)胞數(shù)目隨腦內(nèi)炎癥的消散而逐漸減少。結(jié)論:慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效的將目的基因?qū)肴思?xì)胞系和hmdm,且不引起hmdm明顯的免疫激活。受試人類細(xì)胞系和原代hmdm表達(dá)的hutat2:fc融合蛋白具有與完全tat單克隆抗體相似的神經(jīng)保護(hù)和抑制hiv復(fù)制的效果。小鼠bmdm可在腦內(nèi)炎癥情況下遷徙入大腦并聚集在患側(cè)炎性部位周圍。本研究為利用以Hutat2:Fc為工具的、以單核/巨噬細(xì)胞為基因運(yùn)載工具的HAND的基因治療奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.91;R749.1
【圖文】：

1. HIV 感染的單核/巨噬細(xì)胞遷徙入腦并引起神經(jīng)細(xì)胞損失示意圖[80]。（1）已 T 細(xì)胞直接接觸星狀細(xì)胞，通過病毒突觸感染星狀細(xì)胞；（2）感染星狀細(xì)胞后，因組形成潛伏感染；（3）HIV 感染的單核/巨噬細(xì)胞在感染早期即可進(jìn)入大腦，繼血管旁巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞播散；（4）HIV 感染的星狀細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)毒毒性蛋白（Tat 和 gp120）和前炎性細(xì)胞因子和趨化因子造成神經(jīng)細(xì)胞損傷；（系統(tǒng)內(nèi) HIV 持續(xù)低水平的復(fù)制促進(jìn)慢性活化的 T 細(xì)胞入腦，通過釋放前炎性細(xì)胞神經(jīng)元損傷。在HAND的發(fā)病機(jī)制中，Tat的神經(jīng)毒性作用最為廣泛。Tat是一個(gè)保守的子蛋白，是 HIV-1 轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵的反式激活因子，也是 HIV 感染后最先表達(dá)。常用的抗病毒藥物的靶點(diǎn)是 HIV 蛋白酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，對 HIV 早期病毒蛋Nef 均無拮抗作用 [12, 80]。即使控制了病毒復(fù)制，受感染巨噬細(xì)胞及不斷產(chǎn)生并釋放 Tat 至細(xì)胞外，腦外的 Tat 也可透過 BBB 進(jìn)入 CNS，腦內(nèi)神經(jīng)軸索運(yùn)輸最終引起神經(jīng)遠(yuǎn)程損害 [84]。近年來關(guān)于 Tat 在 HAND 發(fā)

圖 2. 慢病毒載體構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。以 HIV-1 為基礎(chǔ)的慢病毒載體通過三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染 HEK 293T 細(xì)胞獲得。制備的兩種慢病毒載體分別表達(dá)治療性抗 HIV-1 Tat 單鏈抗體Hutat2:Fc 融合蛋白（HR-Hutat2）或陰性對照抗 EBV LMP-1 單鏈抗體 A3H5:Fc 融合蛋白（HR-A3H5）；融合蛋白融合了人 IgG1 引導(dǎo)序列以指導(dǎo)蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表達(dá)，同時(shí)融合了人IgG3 Fc 結(jié)構(gòu)域以增強(qiáng)其穩(wěn)定性和標(biāo)記蛋白產(chǎn)物。LTR: 長末端重復(fù)；ψ: 包裝信號；SD: 剪接供體；SA: 剪接受體；CMV：巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子；scFv:Fc：編碼抗 Tat Hutat2:Fc 或抗 EBV LMP-A3H5:Fc 融合蛋白的結(jié)構(gòu)；Fc：人 IgG1 鉸鏈區(qū)和 IgG3 Fc 結(jié)構(gòu)域；IRES：內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)；EGFP：增強(qiáng)綠色熒光蛋白；gag、pol、vif、vpu、rev、tat、nef：HIV-1 相關(guān)蛋白；Insulinp（A）：胰島素多聚（A）尾巴；VSV-G：水皰性口炎病毒 G 蛋白；SV40 poly（A）：猴空泡病毒 40 多聚（A）尾巴。2) 鈣磷沉淀法轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞[241, 242]A HEK 293T 細(xì)胞培養(yǎng)在 DMEM-10%FBS 培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染前一天將培養(yǎng)的 HEK293T 細(xì)胞按 1:4-1:5 比例傳代接種至 T75 培養(yǎng)瓶中，使其分散均勻，次日應(yīng)

andard error means，s.e.m）。獨(dú)立樣本間顯著性差異采用 Student’s t-檢3 個(gè)或 3 個(gè)以上實(shí)驗(yàn)組間統(tǒng)計(jì)學(xué)意義采用 One-way ANOVA 和 Tuke hoc 檢驗(yàn)。 各實(shí)驗(yàn)組與對照組的比較采用 Dunnett 檢驗(yàn)。P 值為雙尾統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。結(jié)果轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定合成抗 HIV-1-Tat Hutat2:Fc 和抗 EBV LMP-1A3H5:Fc 的 DNA 片段質(zhì)粒骨架 pHR-cPPT-CMV-IRES-EGFP-SIN，得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pH組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pHR-A3H5。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感染態(tài)細(xì)胞后，小提質(zhì)粒，經(jīng) Bam、1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定（圖 3A），以及 PCR 擴(kuò)增確定插入正確（圖 3B）。隨后進(jìn)行下一步細(xì)菌培養(yǎng)、大提質(zhì)粒獲得相應(yīng)質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)所需的包裝質(zhì)粒 pCMV-△R8.2 和包膜質(zhì)粒 pCMV-VSV-G。

【共引文獻(xiàn)】

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2 張燦;沈詩洋;平其能;;以細(xì)胞為載體的藥物遞送系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];中國新藥雜志;2014年16期

3 李珊;陳恩德;周燕;;NMDA受體在HIV相關(guān)認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)中的作用[J];中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志;2015年01期

4 康文;汪春付;孫永濤;;HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知紊亂的臨床研究進(jìn)展[J];中國艾滋病性病;2015年05期

本文編號：2792026