【摘要】：柑橘是世界上最重要的果樹作物之一,在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛分布。柑橘屬(Citrus L.)由林耐于1753年訂立,系蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科(Aurantioideae)植物。Swingle于1943年,根據(jù)雄蕊數(shù)目及汁胞構(gòu)造將柑橘及其近緣的五個屬,金柑屬(Fortunella Swingle)、枳屬(Poncirus Raf.)、澳指檬屬(Microcitrus Swingle)、澳沙檬屬(Eremocitrus Swingle)及多蕊橘屬(Clymenia Swingle)一起劃分到真正柑橘果樹類。柑橘及其近緣屬植物具有豐富的生物活性物質(zhì),如類黃酮,類胡蘿卜素、萜類等,并被報道具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性。枳橙(Citrus sinensis x Poncirus trifoliata)是柑橘屬與枳屬的屬間雜種。枳橙具有發(fā)達(dá)的根系和良好的抗寒抗病能力,在園藝栽培中被作為柑橘砧木廣泛使用。在前人報道中枳橙的親本枳和甜橙都富含如類黃酮等的生物活性物質(zhì)。然而,有關(guān)枳橙果實的類黃酮成分分布,以及其相關(guān)的生物活性如抗氧化、抗肥胖等仍尚未見報道。本研究選取了四種常見的枳橙基因型,分別是卡里佐枳橙(cv.Carrizo,縮寫C)、墨西哥枳橙(cv.Moxico,縮寫M)、臘斯克枳橙(cv.Rusk,縮寫R)、安陸枳橙(cv.Anlu,縮寫A),以及卡里佐枳橙的親本枳(Poncirus trifoliate Raf.,縮寫T)和華盛頓甜橙(Citrus sinensis cv.Washington,縮寫W)研究各果實提取物的黃酮類成分和抗氧化活性。首先,采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜(Ultra Performance Liquid Chromatography-Q time of flight mass spectrometry,UPLC-Qtof-MS)對枳橙果實提取中的黃酮成分進(jìn)行了鑒定。然后,通過高效液相色譜系統(tǒng)(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)和柱后衍生(Post-column Derivatization,PCD)系統(tǒng)聯(lián)用,通過HPLC-ABTS方法,實現(xiàn)了在分離柑橘果實提取物中各黃酮類成分的同時,對各成分清除ABTS+自由基的速率進(jìn)行了分析。此外,進(jìn)行了快速高效的HPLC-ABTS-FRSD(柱后不同自由基檢測系統(tǒng),Free Radical Scavenger Detector,FRSD)對各枳橙樣品總抗氧化活性的測定,并和離線抗氧化檢測方法相結(jié)合,對各樣品抗氧化能力以及其與總多酚總黃酮含量間的關(guān)系進(jìn)行了分析。其次,為評價枳橙果實預(yù)防肥胖的功效,利用高脂膳食誘導(dǎo)的營養(yǎng)肥胖小鼠模型,我們對卡里佐枳橙果皮和果肉提取物對C57/BL6小鼠的體重的抑制以及相關(guān)的高血糖和脂代謝異常等的預(yù)防進(jìn)行了研究。最后,我們利用實時熒光定量PCR技術(shù)對卡里佐枳橙提取物在過氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARγ)以及肝臟X受體β(liver X receptorβ,LXRβ)等核受體信號通路中的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了探討。有關(guān)重要研究結(jié)果如下:1.枳橙果實黃酮類成分鑒定為了鑒定4種枳橙及2種可能親本基因型果皮和果肉甲醇提取物中的類黃酮成分,利用UPLC-Qtof-MS系統(tǒng)對提取物進(jìn)行分析,并通過標(biāo)準(zhǔn)品以及質(zhì)譜碎片斷裂方式對信號進(jìn)行鑒定。使用系統(tǒng)條件:(1)色譜條件:流動相:A為甲醇,B為0.1%甲酸溶液;梯度洗脫程序條件:0—0.6 min 90%—80%A;0.6—6.5 min 80%—40%A;6.5—7 min40%—10%A;7—8 min 10%—90%A;流速:0.4 m L min-1;(2)離子化方式為ESI,毛細(xì)管電壓0.45 k V;錐孔電壓40 V;離子源溫度為100℃;錐孔氣流速50 L/h;脫溶劑氣溫度400℃;去離子氣流速600 L/h;掃描范圍從100 m/z到1000 m/z.數(shù)據(jù)響應(yīng)時間為0.2 s。結(jié)果根據(jù)信號的質(zhì)荷比鑒別出34種化學(xué)成分。其中,鑒定出卡里佐枳橙果皮中的黃酮類成分最豐富為20種,親本材料枳和華盛頓臍橙果皮中的黃酮類成分分別是8和9種。通過和親本枳和華盛頓臍橙對比,卡里佐臍橙果皮提取物中黃酮類生物活性物質(zhì)種類以及等主要成分的含量表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢。此外,卡里佐枳橙提取物中的黃酮成分基本囊括了親本的所有黃酮成分。各柑橘果皮中的黃酮類成分種數(shù)均高于果肉中的種數(shù)。四種枳橙果實提取物的類黃酮成分組成差異不大,無明顯變異,其特征峰主要為新北美圣草苷(neoeriocitrin)、柚皮苷(naringin)、新橙皮苷(neohesperidin)和枸橘苷(ponrincin)。2.枳橙果實抗氧化活性分析2.1 HPLC-ABTS+分析枳橙果實各黃酮成分的抗氧化活性實驗系統(tǒng)條件如下:HPLC分析系統(tǒng):流動相:A為甲醇,B為0.1%甲酸溶液;梯度洗脫￥程序條件:0—20 min 37%—50%A;20—35 min 50%—80%A;35—40min 80%—100%A;40—50 min 100%A;50—60 min 37%A,;流速:0.7 m L min-1;柱溫:25°C;進(jìn)樣體積30μL;PAD檢測波長為283nm類黃酮成分。(2)柱后分析系統(tǒng):ABTS+自由基溶液泵入流速為0.40 m L min-1,檢測波長設(shè)定為414 nm;柱后自由基衍生反應(yīng)系統(tǒng)溫度為40°C。結(jié)果表明,在枳橙果皮提取物中貢獻(xiàn)主要抗氧化能力的黃酮成分為新北美圣草苷,新橙皮苷和枸橘苷也具有較弱的抗氧化能力貢獻(xiàn);而在枳橙果肉以及枳和華盛頓臍橙果實提取中,則沒有黃酮成分明顯地顯示出在線清除ABTS+能力。2.2 HPLC-FRSD測定枳橙果實提取物總抗氧化活性實驗系統(tǒng)條件如下:HPLC分析系統(tǒng):流動相:A為甲醇,B為0.1%甲酸溶液;等度洗脫程序條件:37%A,63%B;流速:0.91 m L min-1;保護(hù)柱柱溫:30°C;進(jìn)樣體積30μL;PAD檢測波長為283nm類黃酮成分。(2)柱后分析系統(tǒng):ABTS+自由基溶液引入流速均為0.60 m L min-1。ABTS+自由基溶液檢測波長為414 nm;柱后自由基衍生反應(yīng)系統(tǒng)溫度為40°C。每個樣品抗氧化活性分析時間為4 min。結(jié)果顯示6種柑橘果皮果肉的抗氧化活性順序(VE當(dāng)量)為:墨西哥果皮(85.00±0.24)安陸果皮(84.27±1.18)卡里佐果皮(83.45±0.97)Rusk果皮(80.45±0.63)枳果皮(77.59±0.72)華盛頓臍橙果皮(74.60±0.45)華盛頓臍橙果肉(73.10±0.07)墨西哥果肉(71.73±1.47)卡里佐果肉(70.23±0.06)安陸果肉(69.94±0.15)Rusk果肉(65.53±1.06)枳果肉(58.87±0.45)。2.3離線測定枳橙果實提取物總抗氧化活性通過DPPH法,ABTS法和FRAP法三種離線法測定6種柑皮和果肉甲醇提取物的抗氧化活性,并結(jié)合在線ABTS法檢測的結(jié)果,利用抗氧化活性綜合指數(shù)￥評價其抗氧化活性。結(jié)果顯示6種柑橘果皮果肉的抗氧化活性順序(APC綜合評價指數(shù))從高到低依次為:墨西哥果皮(97.03%)安陸果皮(94.95%)卡里佐果皮(86.67%)臘斯克果皮(84.38%)枳果皮(76.75%)華盛頓臍橙果皮(73.20%)華盛頓臍橙果肉(56.46%)卡里佐果肉(55.07%)墨西哥果肉(54.13%)Rusk果肉(52.22%)安陸果肉(47.28%)枳果肉(40.15%)。2.4枳橙果實總抗氧化活性與總酚總黃酮含量相關(guān)性本文通過福林酚法和氯化鋁法分別測定了枳橙果實的總酚含量和總黃酮含量,并分析各種方法測定抗氧化活性與總酚含量總黃酮含量與的關(guān)系。(1)枳橙果實總酚含量測定。果皮提取物中總酚含量最高的為墨西哥枳橙。果肉提取物中總酚含量最高的為華盛頓臍橙和墨西哥枳橙。(2)枳橙果實總黃酮含量測定。果皮提取物中總黃酮含量最高的為墨西哥枳橙和卡里佐枳橙;果肉提取物中總黃酮含量較高的為華盛頓臍橙。(3)相關(guān)性分析顯示柑橘果實的抗氧化活性與酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)總含量,呈現(xiàn)顯著性正相關(guān)(p0.05)。表明酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)是潛在柑橘抗氧化活性貢獻(xiàn)者。3.枳橙果實提取物抗肥胖活性分析雌性C57BL/6小鼠被分別飼喂對照低脂飼料,高脂飼料(HF),高脂飼料添加1%w/w卡里佐枳橙果皮提取物(CPE)或1%w/w卡里佐枳橙果肉提取物(CFSE)共計8周。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CPE和CFSE都具有減輕高脂膳食誘導(dǎo)的營養(yǎng)性肥胖能力。在CPE和CFSE處理組中,CPE和CFSE能夠抑制高脂膳食造成的小鼠體重增長,空腹血糖水平提高(p0.05),此外CPE能夠降低血清中總膽固醇水平(p=0.004),低密度脂蛋白膽固醇水平(p=0.042)。肝臟切片結(jié)果顯示CPE和CFSE能抑制小鼠肝臟中脂質(zhì)的積累,并且和HF組比較,HF+CFSE組小鼠肝臟總膽固醇水平下降(p=0.002)。通過實時熒光定量PCR對小鼠肝臟中基因表達(dá)水平檢測,我們發(fā)現(xiàn),CPE和CFSE可以降低PPARγ的表達(dá)水平(p0.05),顯著抑制(adipocyte fatty-acid-binding protein,ap2)和凋亡相關(guān)因子(factor associated suicide,FAS)等PPARγ靶基因的表達(dá)水平(p0.05)。此外,CPE還能抑制LXRβ及其靶基因脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)的表達(dá)水平(p0.05),CFSE可抑制載脂蛋白E(apolipoprotein E,Apo E)的m RNA的表達(dá)(p=0.032)。綜合以上實驗結(jié)果,我們可以得出以下實驗結(jié)論:枳橙果實中主要的黃酮成分為黃酮-O-糖苷類化合物;枳橙及枳橙親本果皮提取物中的化學(xué)成分多于果肉中的;枳橙果實提取物中的黃酮成分分布和抗氧化能力無顯著差異;卡里佐枳橙的抗氧化能力較可能親本枳和華盛頓臍橙顯示出了雜種優(yōu)勢;枳橙果實提取物能夠預(yù)防由高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠的營養(yǎng)性肥胖;枳橙果實提取物可能通過PPARγ和LXRβ等核受體信號通路起到調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R284;R285;S666
【圖文】：

類黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖 3-1 實驗材料：（A）小葉枳；（B）華盛頓臍橙；（C）卡里佐枳橙；（D）安陸枳橙；（E）墨西哥枳橙；（F）臘斯克枳橙。Fig 3-1 Citrus Samples：（A）Xiaoye Trifoliate Orange; (B) Washiton Sweet Orange; (C)Carrizo Citrange; (D) Mexico Citrange; (E) Anlu Citrange; (F) Rusk Citrange3.1.2 主要實驗試劑和儀器設(shè)備3.1.2.1 實驗試劑甲醇（Methanol，色譜純，Sigma-Aldrich，美國）；甲酸（formic acid，色譜純，Waters，美國）。標(biāo)準(zhǔn)品圣草次苷（eriocitrin）、蕓香柚皮苷（narirutin）、新橙皮苷（neohesperidin）、柚皮苷（naringin）、橙皮苷（hesperidin）、 野漆樹苷（rhoifolin）、 枸橘苷（ponrcin）和橙黃酮（sinensetin）購買自 ChromaDex (ChromaDex Inc, 美國)； 新北美圣草苷（neoeriocitrin）購買自 Sigma-Aldrich （Sigma，美國）；橘皮素（tangeretin）購買

圖 3-2 UPLC-Qtof MS 鑒定枳橙果皮甲醇提取物中的化學(xué)成分：（A）TPE；（B）WPE；（CCPE；（D）APE；（E）RPE；（F）MPE。Fig 3-2 Identification of the chemical compounds of citrange peel methanol extracts：(A）TP（B）WFSE，（C）CFSE，（D）AFSE，（E）RFSE，（F）MFSE

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2781732