【摘要】：背景:先天性心臟病(Congenital Heart Disease,CHD)是由于胎兒的心臟在母體內發(fā)育缺陷或部分發(fā)育停頓所造成的畸形,簡稱先心病,發(fā)病率0.8-1%,是目前最常見的出生缺陷,而且也一直是引起嬰幼兒死亡的首要原因。我國每年新增CHD嬰兒約16-20萬,CHD不僅可導致胎兒生長發(fā)育遲緩,而且常導致流產、死胎等。如果CHD得不到及時救治,30%的嬰兒在嬰兒期死亡,即使存活也常繼發(fā)心、腦、肺等重要器官損害,嚴重影響患兒的生活質量及身心健康,給家庭及社會帶來沉重的經濟壓力和精神負擔。因此,深入探討胚胎心臟發(fā)育畸形的機制,從根本上控制和降低先心病的發(fā)生率,已成為預防醫(yī)學領域早期防治的一個重點研究內容。先天性心臟病(CHD)的病因迄今尚未完全闡明,盡管多數(shù)學者認為CHD是胚胎心臟從原始心管到發(fā)育成熟過程中由環(huán)境和/或遺傳因素共同作用導致的發(fā)育異常,但研究發(fā)現(xiàn)單純由環(huán)境因素引起的CHD僅占2-5%,更多的則與遺傳或基因缺陷有關。心臟發(fā)育過程極其復雜,涉及許多相關基因依時空順序差次表達以及多條信號通路的精確調控,任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)紊亂都有可能影響心臟發(fā)育、導致CHD的發(fā)生。目前已發(fā)現(xiàn),Nkx2-5、GATA4、MEF2A、MEF2C、TBX5等基因以及Wnt、Notch等信號通路與心臟發(fā)育密切相關,為理解先心病的發(fā)生發(fā)展提供了分子基礎與線索,但胚胎心臟發(fā)育異常的分子調控網(wǎng)絡尚未完全清楚,因此繼續(xù)挖掘新的調控因子仍極其重要。近年來,生命科學研究進入后基因組時代,2003年9月的ENCODE計劃揭示,原先被認為“轉錄噪音”的非編碼RNA,絕大部分也具備生物學功能,越來越引人關注。非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)極大拓展了人們對疾病發(fā)生發(fā)展機制的理解,目前mi RNA(長度大約22nt、在轉錄后水平負向調控編碼基因的非編碼RNA)的研究最為活躍,已有大量文獻報道了mi RNA在心臟發(fā)育、心血管疾病中的重要作用與機制;而長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA,轉錄本長度大于200nt的非編碼RNA),由于:①種類、數(shù)量、功能、以及作用機制都遠豐富于mi RNA;②具有基因修飾、染色體重組、m RNA穩(wěn)定性、表觀遺傳、基因轉錄和轉錄后調節(jié)、蛋白質合成代謝及功能調節(jié)等重要生物學功能;③與胚胎發(fā)育及諸多疾病的發(fā)生密切相關;④可能是RNA世界的一個調節(jié)樞紐,已引起研究人員的高度關注。盡管目前有關lnc RNA在心血管領域中的研究還鮮有報道,但毋容置疑,探索lnc RNA在心臟發(fā)育中作用與機制將進一步加深對心臟發(fā)育機制的理解。第一部分心臟發(fā)育相關lnc NRAs的篩選與整合分析目的:1)檢測室間隔缺損胚胎心臟與正常對照心肌組織之間的lnc RNAs表達譜;2)篩選與心臟發(fā)育異常相關的lnc RNAs,為后續(xù)功能研究提供數(shù)據(jù)積累。方法:1)以超聲診斷為室間隔缺損的人孕17周胚胎心臟組織樣本為檢測對象、同孕周非疾病因素人工流產的胚胎心臟組織樣本為對照,采用美國Arraystar公司lnc RNAs芯片技術檢測兩組之間lnc RNAs和m RNAs的表達情況,對原始數(shù)據(jù)預處理、均一化后進行統(tǒng)計分析,以2倍以上變化且具有統(tǒng)計學意義(P0.05)為判斷標準,篩選出差異表達的lnc RNAs和m RNAs;2)隨機選取芯片結果中差異表達的10條lnc RNAs,采用Real-Time PCR方法驗證芯片數(shù)據(jù)的重復性與可靠性;3)對差異表達的m RNAs進行GO分析和KEGG通路分析;4)依據(jù)序列保守性、心臟發(fā)育相關性、組織特異性等標準,篩選出與心臟發(fā)育可能密切相關的lnc RNAs;5)對篩選出的lnc RNAs進行生物信息學分析,預測其靶基因及潛在的生物功能。結果:1)對芯片原始數(shù)據(jù)進行標準化處理和兩組比較后,差異表達的lnc RNAs為1508條,其中上調880條,下調628條;差異表達的m RNA1784條,其中上調691條,下調1093條;2)RT-PCR驗證結果與芯片數(shù)據(jù)基本一致;3)GO分析結果顯示,差異表達的lnc RNAS主要涉及發(fā)育過程、細胞增殖、細胞周期、細胞分化、DNA復制、DNA修復、糖分子綁定、蛋白綁定、細胞表面以及一些糖、脂代謝等功能。Pathway分析結果顯示,差異表達的lnc RNAS參與的信號通路包括JAK-STAT signaling pathway、Wnt signaling pathway、Hedgelog signaling pathway等,這些信號通路與心臟發(fā)育密切相關;4)通過制定的篩選標準共篩選出10條與心臟發(fā)育密切相關的lnc RNAs,它們都有較高的保守性與組織特異性,分別為:ENST00000513542、RP11-473L15.2、uc.167、HIT000242541、BX648912、BC040935、AY927503、LOC440839、G65566、AK127225;5)生物信息學分析顯示ENST00000513542、RP11-473L15.2這兩條lnc RNAs染色體區(qū)域存在豐富的表觀遺傳調控信息,包括多種組蛋白修飾方式、DNA甲基化等,并且受多個發(fā)育相關轉錄因子結合調控。結論:1)與正常對照相比,室間隔缺損胚胎心肌組織中的lnc RNAs表達譜發(fā)生了顯著變化,提示lnc NRAs可能參與了心臟發(fā)育過程的調節(jié)。2)經Real-time PCR驗證,lnc RNAs芯片結果可靠,可用于后續(xù)分析。第二部分lnc RNA-uc.167的生物信息學分析及時空表達特征目的:1)采用生物信息學方法探索uc.167潛在功能的重要性;2)分析uc.167的基本生物學特征,包括uc.167在小鼠心臟發(fā)育過程中的空間分布特征、時間表達規(guī)律以及uc.167在P19細胞向心肌細胞分化過程中的時間表達規(guī)律。方法:1)借助ENCODE的UCSC genome browser對篩選出的lnc RNAs進行初步的生物信息學分析;利用相關數(shù)據(jù)庫預測與lnc RNAs結合TFBs的元件。采用cat RAPID algorithm預測RNA與蛋白之間相互作用;2)取不同階段(P8.5、P11.5、P14.5、P18.5)的胚胎小鼠心臟,使用RT-PCR方法檢測uc.167及鄰近基因在心肌組織中的表達情況,并采用原位雜交技術檢測uc.167在心肌組織內的分布情況;3)采用DMSO方法誘導P19細胞向心肌細胞方向分化,采用RT-PCR方法檢測分化過程中uc.167及鄰近基因的表達變化。結果:1)人uc.167全長201bp,定位于基因組5q14.3(chr5:88179623-88179824,GRCh37/hg19),根據(jù)lnc RNA分類原則,屬Intronic antisense lnc RNA;2)uc.167相關染色體區(qū)域受CEBPB、GATA2、SRF等多個重要轉錄因子結合調控,該染色體區(qū)域存在非常豐富的表觀遺傳調控信息,如多種組蛋白修飾方式、DNA甲基化等;3)uc.167主要表達于心室肌組織內;在小鼠胚胎心臟發(fā)育過程中uc.167表達逐漸下調,而其鄰近基因Mef2c表達逐漸上調,兩者呈相反趨勢;4)uc.167在P19細胞向心肌細胞分化的過程中,呈現(xiàn)“先升后降”的表達模式,在胚胎樣小體形成(d4)時表達水平達到最高,而后逐漸下調,臨近基因Mef2c的表達變化與其呈相反趨勢。結論:1)uc.167可能具有重要的潛在的生物學功能;2)uc.167可能通過負向調控其鄰近基因Mef2c來發(fā)揮作用。第三部分lnc RNA-uc.167在胚胎心臟發(fā)育中的功能與相關機制研究目的:1)探索uc.167對P19細胞增殖、周期、凋亡及分化的影響及相關機制;2)探索uc.167在小鼠心臟發(fā)育過程中的作用及可能機制。方法:1)設計并構建lnc RNA-uc.167過表達載體,將其與空白對照載體分別轉染P19細胞,并用嘌呤霉素篩選14d,采用RT-PCR方法驗證并獲得穩(wěn)定表達細胞株,采用CCK-8法檢測細胞增殖、流式細胞儀檢測uc.167過表達對P19細胞周期的影響、RT-PCR方法檢測其對P19細胞分化的影響,并用磷脂酰外翻法、Capase-3活性檢測及Hoechst染色等方法分析其對細胞凋亡的影響;2)設計Mef2c過表達載體,與uc.167共轉染P19細胞,檢測P19細胞增殖、周期、凋亡及分化情況;3)通過胚胎顯微注射方法構建uc.167心肌組織特異性轉基因小鼠,采用心臟超聲、HE、Masson染色等實驗技術對其表型進行初步分析。結果:1)成功構建uc.167過表達載體并獲得uc.167穩(wěn)定過表達細胞株,uc.167過表達可顯著抑制細胞增殖,使其受阻于S/G2期,并促進細胞凋亡,uc.167過表達顯著抑制P19細胞向心肌細胞方向分化;2)Mef2c與uc.167共同過表達可挽救uc.167過表達對P19細胞造成的不利影響;3)在觀察期內,uc.167轉基因小鼠并未出現(xiàn)明顯的心臟畸形表型:與正常對照相比,轉基因小鼠的心臟結構、心功能參數(shù)均無明顯變化;心肌組織形態(tài)結構、纖維化程度也未發(fā)生顯著變化。結論:1)uc.167過表達可產生明顯的細胞表型,顯著影響P19細胞的增殖、周期、凋亡及細胞分化;2)uc.167可能通過負向調控其臨近基因Mef2c發(fā)揮生物學功能;3)uc.167在心臟發(fā)育過程中具有一定的調節(jié)作用,但并不是唯一性、關鍵性的,而是可能作為一個“微效基因”與其他基因共同發(fā)揮調控作用。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.1

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本文編號：2780366