【摘要】：研究背景及目的膽汁淤積(cholestasis)是多種疾病和生理狀態(tài)所致的常見臨床綜合癥,其病因包括如：(病毒性和非病毒性)肝炎(hepatitis)、肝硬化(liver cirrhosis)、脂肪肝(fatty liver)、感染(infection)、膽道阻塞(bile duct obstruction)、遺傳病(genetic diseases)、孕娠(pregnant)等。在膽汁淤積狀態(tài)下,肝細(xì)胞內(nèi)不斷積聚的毒性膽汁酸(toxic bile acids)造成肝臟損傷,激發(fā)肝臟產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)(Adaptive responsive),即膽汁酸代謝基因表達(dá)發(fā)生適應(yīng)性改變：(1)Phase 0(攝入)相Ntcp、Oatps等表達(dá)下降,減少膽汁酸向肝細(xì)胞內(nèi)泵入；(2)Phase Ⅰ(合成)相Cyp7a1、Cyp8b1等膽汁酸合成相關(guān)的酶類表達(dá)下調(diào),減少肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的生成；(3)Phase Ⅱ(解毒)相Ugts、 Sults、 Gsts等膽汁酸硫酸化、葡萄糖苷化、谷胱甘肽化有關(guān)的酶表達(dá)增強(qiáng),從而增加膽汁酸的水溶性、降低膽汁酸的毒性；(4)Phase Ⅲ(排泌)相的膽酸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mrp3、Mrp、Ostα/β的表達(dá)顯著上調(diào),增強(qiáng)肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的排泌,減少毒性膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)的積聚。然而,目前對于膽汁淤積適應(yīng)性反應(yīng)的分子機(jī)制的認(rèn)知,主要來源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外細(xì)胞培養(yǎng)。由于活體動(dòng)物、體外細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境均與人體存在顯著差異。因此,對于阻塞性膽汁淤積下肝臟是否產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)以及其具體的分子機(jī)制尚不清楚。尤其值得注意的是膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP2/ABCC2,其定位表達(dá)于肝細(xì)胞膽管面膜,主要排泌結(jié)合膽紅素、膽汁酸等有機(jī)陰離子化合物。但是,MRP2單基因缺失或突變會導(dǎo)致以高膽紅素血癥和膽汁酸增高為主要癥狀的Dubin-Jonhson綜合征[。因此,MRP2在膽汁淤積發(fā)生、發(fā)展中功能極其重要。近期文獻(xiàn)報(bào)道,雌激素誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠肝臟Mrp2 mRNA和總蛋白水平表達(dá)無明顯變化,而肝細(xì)胞膽管面膜Mrp2表達(dá)顯著減少。前期研究也表明,阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2 mRNA表達(dá)也無明顯變化。因此,我們推測阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2蛋白表達(dá)減少可能為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,細(xì)胞骨架蛋白Radixin基因缺失會導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞膽管面膜Mrp2表達(dá)缺失,從而引起高膽紅素血癥。有細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)研究表明,Radixin和Ezrin基因敲減可顯著減少人腸上皮細(xì)胞株Caco2細(xì)胞膜上的MRP2蛋白的表達(dá)。此外,Ezrin Thr567磷酸化與大鼠腸道上皮細(xì)胞頂膜MRP2蛋白定位表達(dá)密切相關(guān),而且PKCa具有決定其表達(dá)定位的作用。并且,膽汁淤積動(dòng)物模型肝臟PKC被活化,能夠在不影響肝臟MRP2 mRNA表達(dá)的情況下而減少肝細(xì)胞膜上MRP2蛋白的表達(dá)。最新研究表明,蛋白激酶C (PKC)可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的Ezrin Thr567磷酸化[24]。因此,我們提出人阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子機(jī)制假設(shè)：阻塞性膽汁淤積時(shí),肝臟蛋白激酶PKC被活化,誘導(dǎo)骨架蛋白Ezrin Thr567磷酸化,促使肝細(xì)胞膽管面膜MRP2內(nèi)吞,最后經(jīng)由蛋白酶體降解途徑(ERAD)降解。在本研究中,我們收集人阻塞性膽汁淤積組和正常對照組病人肝臟組織,運(yùn)用Realtime qPCR(SYBR)、 Western-blot、免疫共沉淀、免疫熒光、免疫組化、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株等技術(shù),闡明人阻塞性膽汁淤積肝臟的適應(yīng)性反應(yīng)以及驗(yàn)證MRP2轉(zhuǎn)錄后下調(diào)的分子機(jī)制假設(shè)。研究方法1.收集人阻塞性膽汁淤積組和正常對照組肝臟組織,一部分用4%多聚甲醛固定；一部分剪成小塊后,凍存于液氮罐保存,用于總RNA、總蛋白、總膜蛋白、核蛋白等提取。2. Real time qPCR(SYBR)檢測阻塞性膽汁淤積組、對照組肝臟膽汁酸合成酶(CYP7B1、CYP8B1、CYP27A1),肝臟解毒酶(UGT2B4/7、SULT2A1、GSTA1-4、 GSTA1-5、肝細(xì)胞基底側(cè)膜膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(OSTα/β、OCT1)、肝細(xì)胞膽管面膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2、ABCG5/8)以及調(diào)節(jié)相關(guān)核受體(VDR、PPARα、HNF1α、HNF4α、RXRα) RARα、LXR、FXR、SHP)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF3β、NRF2β、AHR)的mRNA水平的表達(dá)情況。3. Western-blot檢測上述基因在阻塞性膽汁淤積組和正常對照組的蛋白表達(dá)水平。4.免疫熒光檢測膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OSTα/β、OCT1、ABCG2、ABCG8和核受體VDR、HNF4α、RARα、FXR在阻塞性膽汁淤積組和正常對照組的蛋白表達(dá)定位情況。5. Real time qPCR(SYBR)檢測阻塞性膽汁淤積組、對照組肝臟骨架蛋白(Ezrin、 Radixin)、蛋白激酶C(PKCα、PKCδ、PKCε)、泛素連接酶E3s(gp78、TEB4、HRD1)的mRNA水平的表達(dá)情況。6. Western-blot檢測上述基因在阻塞性膽汁淤積組、對照組的蛋白表達(dá)情況。同時(shí)還檢測,Ezrin Thr567磷酸水平的情況。7.免疫熒光和免疫組化檢測MRP2、Ezrin、磷酸化Ezrin Thr567在阻塞性膽汁淤積組、對照組肝臟表達(dá)定位情況。8.通過免疫共沉淀技術(shù),研究Ezrin(磷酸化Ezrin Thr567)、Radixi、PKCα、PKCδ PKCε、 MRP2泛素化之間的相互作用。9.構(gòu)建Ezrin野生型及突變體、PKCa野生型及突變體等HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后,通過Real time qPCR、Western-blot等檢測其mRNA、總蛋白、總的膜蛋白和生物素標(biāo)記的膜蛋白的MRP2表達(dá)情況。結(jié)果1.阻塞性膽汁淤積下膽汁酸合成經(jīng)典途徑(CYP7A1)被抑制；而替代途徑(CYP7B1、CYP8B1)被激活。2.阻塞性膽汁淤積下肝臟解毒酶UGT2B、SULT2A1、GSTA1-4、GSTM1-4蛋白表達(dá)顯著減少。3.阻塞性膽汁淤積下肝細(xì)胞基底側(cè)膜OSTβ、OCT1表達(dá)顯著增高、OSTα蛋白表達(dá)明顯減少；膽管面膜ABCG2、ABCG8表達(dá)顯著減少。4.阻塞性膽汁淤積下肝臟核受體FXR表達(dá)顯著減少；VDR、RARα、HNF4α表達(dá)顯著增加。5.阻塞性膽汁淤積下核受體FXR表達(dá)顯著減少,與肝臟解毒酶UGT2B、SULT2A1、GSTA1的表達(dá)減少存在顯著正相關(guān)。6.阻塞性膽汁淤積下肝細(xì)胞膽管面膜MRP2表達(dá)顯著減少；總蛋白MRP2表達(dá)也明顯減少。7.阻塞性膽汁淤積下肝細(xì)胞骨架蛋白Radixin和Ezrin表達(dá)無明顯變化。但是,EzrinThr567磷酸化水平在膽汁淤積肝臟顯著增高,其脫磷酸化可影響Ezrin與MRP2蛋白間的相互作用。在HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株水平,Ezrin Thr567磷酸化可明顯減少肝細(xì)胞膜MRP2的表達(dá)。8.阻塞性膽汁淤積下PKC在mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著增加。而通過肝臟組織樣品和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)證明,PKCa可誘導(dǎo)Ezrin Thr567磷酸化,同時(shí)減少肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞膜上MRP2的表達(dá)。9.阻塞性膽汁淤積下泛素連接酶E3 gp78表達(dá)和MRP2泛素化明顯增加。在HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,gp78干擾后可增強(qiáng)總蛋白MRP2的表達(dá)。結(jié)論通過本研究表明,阻塞性膽汁淤積時(shí),肝臟產(chǎn)生自我保護(hù)、適應(yīng)性反應(yīng),一方面激活膽汁酸替代途徑(如CYP7B1、CYP8B1增高),另一方面增強(qiáng)肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸排泌(如OSTβ增高),減輕肝臟損傷。但是,由于肝臟解毒酶(如UGT2B、SULT2A1、GSTA1)的表達(dá)顯著降低,從而消弱了適應(yīng)性反應(yīng)的效果。我們通過分析發(fā)現(xiàn),阻塞性膽汁淤積下肝臟核受體FXR的減少與肝臟解毒酶表達(dá)(如UGT2B、SULT2A1、GSTA1)降低存在顯著正相關(guān)。這提示,FXR在阻塞性膽汁淤積下肝臟解毒功能消弱發(fā)揮重要的作用。而且,這也能很好的解釋,FXR激動(dòng)劑(如UDCA、INT747)為何具有減輕膽汁淤積病人肝損傷的效果。此外,我們通過研究還發(fā)現(xiàn),阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2表達(dá)下調(diào)為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,其可能的分子機(jī)制：首先,蛋白激酶PKC(PKCα、PKC8、PKCε)表達(dá)增高和激活；其次,PKC誘導(dǎo)Ezrin Thr567發(fā)生磷酸化,從而增強(qiáng)Ezrin與肝細(xì)胞膽管面膜MRP2的蛋白間相互作用；然后,磷酸化的Ezrin Thr567促使細(xì)胞膽管面膜MRP2內(nèi)吞；最后,內(nèi)吞至肝細(xì)胞內(nèi)的MRP2蛋白經(jīng)由泛素連接酶E3 gp78介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑降解。理解和弄清楚膽汁淤積表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制具有極其重要的意義,不僅僅可加深我們對膽汁淤積發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制的理解,而且也能為我們研發(fā)新的治療藥物和靶向治療提供了新的重要線索。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575
【圖文】：

焌積肝臟組織ｍＲＮＡ和蛋白水平表達(dá)均顯著降低［其它與學(xué)位論文相關(guān)的論著１］。與此逡逑截然相反，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膽汁酸合成酶ＣＹＰ７Ｂ１在阻塞性膽汁游積肝臟ｎｉＲＮＡ逡逑和蛋白水平表達(dá)均顯著增高（６．４倍和２．４倍，尸＜０．０１）（圖１－１Ａ－Ｃ）。同時(shí)，另一膽汁酸合逡逑成酶ＣＹＰ犯１在蛋白水平表達(dá)也顯著增高（２．８倍，ｆ＜０．（Ｈ）調(diào)１－１Ｂ、Ｃ），但是在其ｍＲＮＡ逡逑水平無明顯變化（圖１－１Ａ）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，阻塞性膽汁焌積肝臟膽汁酸合成酶逡逑ＣＹＰ２７Ａ１在ｍＲＮＡ和蛋白水平表達(dá)均無明顯變化圖１－１Ａ－Ｃ）。逡逑Ｗ上結(jié)果表明，人阻塞性膽汁焌積下，肝臟膽汁酸經(jīng)典合成途徑受到明顯抑制，而逡逑膽汁酸合成替代途徑被激活。這一方面有利于減少膽汁酸的合成，另一方面還能促使膽逡逑汁酸合成由巧細(xì)胞毒性較大的ＣＤＣＡ轉(zhuǎn)向毒性較小的ＣＡ。逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｌｉｖｅｒｓ邐Ｃｉ邋Ｃ２＾３邋Ｃ＊邋Ｏｉ邋Ｏ２邋Ｏｓ邋0４邋Ｏ＾Ｏｅ邐Ｈ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｌｉｖｅｒｓ逡逑■邋Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ邋ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ邋ｌｉｖｅｒｓ邐灥＾邋秦呵＇邋＇

肝臟膜蛋白ＭＲＰ２的表達(dá)在膽汁游積病人組顯著降低至正常對照組水平的逡逑２５％（戶＜０．０１，國２－１Ａ、Ｃ）。同時(shí)，阻塞性膽汁焌積組中肝臟總蛋白ＭＲＰ２的表達(dá)也明逡逑顯下降至對照組表達(dá)水平的６０％（戶＜０．０１，圖２－１Ｂ、Ｃ）。免疫組化檢測顯示，在阻塞性逡逑膽汁游積下，肝細(xì)胞膽管面膜ＭＲＰ２的蛋白表達(dá)顯著減少（圖２－ｌＤａ、ｂ）。同時(shí)，我還發(fā)逡逑現(xiàn)，在膽汁游積下，肝細(xì)胞膽管面膜ＭＲＰ２的表達(dá)存在明顯的內(nèi)吞（ｉｎｔｅｍａｌｚｉａｔｉｏｎNB圖逡逑２－ｌＤａ＾箭頭）。為了驗(yàn)證觀察到的該現(xiàn)象是否準(zhǔn)確，我們進(jìn)行了邋ＭＲＰ２與ＺＯ－１松認(rèn)的逡逑膽管面膜標(biāo)記ｍａｒｋｅｒ之一）免疫巧光雙標(biāo)。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在膽汁焌積下斤細(xì)胞膽管面逡逑膜ＭＲＰ２表達(dá)顯著減少，送與我們在免疫組化觀察到的結(jié)果相一致調(diào)２－１巧。同時(shí)，我逡逑還發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞膽管面膜結(jié)構(gòu)在膽汁焌積下被破壞，ＭＲＰ２與ＺＯ－１強(qiáng)合顯著減少，ＭＲＰ２逡逑并存在內(nèi)吞現(xiàn)象（圖２－１巧。逡逑前期研究及本次研究結(jié)果表明

ｓｈＲＮＡ＃３邋質(zhì)粒效果最佳（／■＜０．０５，圖邋２－２Ａ）。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ邋結(jié)果表明，ＥｚｒｉｎｓｈＲＮＡ＃３邋質(zhì)逡逑粒能明顯敲減ＨｅｐＧ２細(xì)胞骨架蛋白Ｅｚｒｉｎ的蛋白表達(dá)，而對ＭＲＰ２怠蛋白表達(dá)無明顯影逡逑響（尸＜０．０１，圖２－２Ｂ）。然后，我們利用Ｍｅｍ－ＰＥＲ膜蛋白提取試劑提取細(xì)胞總的膜蛋白，逡逑并做Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ檢測。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，Ｅｚｒｉｎ邋ｓｈＲＮＡ＃３穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Ｈ巧Ｇ２細(xì)胞總的膜逡逑蛋白ＭＲＰ２表達(dá)明顯增高２．２倍（ｆ＜０．０５，圖２－２Ｃ）。為了驗(yàn)證該結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們利逡逑用邋ＥＺ－ＬｉｎｋＴＭＳ山ｆｏ－ＮＨＳ－ＳＳ－Ｂｉｏｔｉｎ邋和邋Ｐｉｅｒｃｅ⑥邋Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ邋Ａｇａｒｏｓｅ邋Ｒｅｓｉｎｓ邋試劑對邋Ｈｑ）Ｇ２逡逑穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行生物素化標(biāo)記后，提取生物素化標(biāo)記的細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ逡逑檢測。與前述結(jié)果相一致，我們發(fā)現(xiàn)Ｅｚｒｉｎ邋ｓｈＲＮＡ沿干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的Ｈｑ）Ｇ２細(xì)胞生逡逑物素標(biāo)記的膜蛋白ＭＲＰ２表達(dá)明顯X椄擼玻保ㄊ跡埃埃�，哇E玻睬傘ｅ義希咨轄峁礱鰨牛潁椋鑠澹螅瑁遙危亮現(xiàn)柿Ｄ芄幌災(zāi)眉酰齲澹穡牽蠶赴羌艿鞍祝牛潁椋畹謀礤義洗鎩＃牛潁椋罨蚯眉鹺�，能够X椙浚齲澹穡牽蠶赴さ鞍祝停遙校駁謀澩錚宰艿鞍祝停遙校插義媳澩鏤廾饗雜跋�。这提�

本文編號：2779284