【摘要】：銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是醫(yī)院感染的最常見(jiàn)病原菌之一。作為條件致病菌,它主要感染免疫功能低下的病人,可以引起燒傷后感染、手術(shù)后傷口感染及肺部感染等。銅綠假單胞菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力極強(qiáng),能在多種環(huán)境中存活,尤其在潮濕環(huán)境中可以長(zhǎng)期生存,常常引起嚴(yán)重的環(huán)境污染及器械設(shè)備污染。銅綠假單胞菌具有極強(qiáng)的耐藥性,能夠抵抗多種抗生素,一旦感染很難被清除。因此,銅綠假單胞菌感染的防御及治療受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。近年來(lái)的研究表明,銅綠假單胞菌的耐藥性主要與其生物被膜(生物膜,Biofilm)的形成有關(guān)。生物被膜是指細(xì)菌粘附于接觸表面,分泌胞外基質(zhì)(Extracellular matrix)并將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌膜狀聚集物。自然界中的大部分細(xì)菌主要以生物被膜的形態(tài)存在。與游離細(xì)胞相比,生物被膜中的細(xì)菌具有極強(qiáng)的耐藥性,能夠更好地耐受抗生素和宿主的免疫反應(yīng),并且在細(xì)胞形態(tài)和生理上會(huì)發(fā)生很大的變化。胞外基質(zhì)是生物被膜的主要組成部分,占到生物被膜總體積的85%,為生物被膜的形成提供支架,并且可以促進(jìn)生物被膜細(xì)胞之間的交流。胞外基質(zhì)主要包括胞外多糖(Extracellular polysaccharide, EPS)、蛋白質(zhì)、核酸、脂類及細(xì)胞殘骸等。其中,胞外多糖又是胞外基質(zhì)的主要成分。銅綠假單胞菌由于分布廣泛、極易形成生物被膜,成為生物被膜研究的模式菌株。鞭毛作為細(xì)菌重要的毒力因子,除了與運(yùn)動(dòng)性相關(guān)之外,還在生物被膜形成初期及微菌落形成過(guò)程中起到了重要的吸附作用。銅綠假單胞菌在菌體的一端生有單根鞭毛,但是其合成和調(diào)控卻需要四十多種基因參與。這些基因根據(jù)表達(dá)及調(diào)控順序的不同共分為四級(jí)。其中,FleQ作為主導(dǎo)調(diào)節(jié)因子,調(diào)控其它基因的轉(zhuǎn)錄。之前的研究發(fā)現(xiàn),FleQ作為一種新型的c-di-GMP受體,還參與EPS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。序列比對(duì)結(jié)果顯示FleQ屬于NtrC雙組分磷酸化家族,但是缺少該家族中保守的磷酸化位點(diǎn)及相應(yīng)的磷酸化激酶。除此之外,序列分析發(fā)現(xiàn)FleQ不含有保守的c-di-GMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此,FleQ與c-di-GMP的結(jié)合方式以及它調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用機(jī)制受到越來(lái)越多的關(guān)注。本文的第一部分主要對(duì)P.aeruginosa PAO1中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白FleQ REC結(jié)構(gòu)域(FleQR)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究。我們對(duì)FleQR進(jìn)行了純化和結(jié)晶,并解析了其晶體結(jié)構(gòu)。通過(guò)與磷酸化蛋白NtrC和StyR的REC結(jié)構(gòu)域進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)FleQR與這些蛋白在結(jié)構(gòu)上存在明顯差異。由于FleQR的這種特殊性,我們首先驗(yàn)證它對(duì)于FleQ發(fā)揮功能是否是必須的。我們構(gòu)建了fleQ的基因敲除與回補(bǔ)菌株,并對(duì)這些菌株進(jìn)行了體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)及體外生化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,REC結(jié)構(gòu)域缺失后,鞭毛基因不能轉(zhuǎn)錄,菌體喪失了移動(dòng)性,并且EPS基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上升。這表明REC結(jié)構(gòu)域?qū)τ贔leQ發(fā)揮功能是必不可少的。我們進(jìn)一步通過(guò)結(jié)構(gòu)分析和生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),FleQR在溶液中以一種" transverse dimer"的形式存在,并且氨基酸F26在二體形成中起到了關(guān)鍵的作用。這種二體形式在其它同源蛋白中尚未被報(bào)道過(guò)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該二體形式對(duì)FleQ發(fā)揮功能是十分重要的,破壞或減弱二體形成會(huì)對(duì)FleQ的功能產(chǎn)生不同程度的影響。除此之外,我們通過(guò)同源建模分析找到了FleQ結(jié)合c-di-GMP的關(guān)鍵氨基酸R144和R185,并且通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)和ITC實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,ATP和c-di-GMP由于結(jié)合位點(diǎn)在空間位置上接近,二者的結(jié)合會(huì)相互影響,并且二體狀態(tài)對(duì)于FleQ結(jié)合c-di-GMP也是必需的。最后,在所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們提出了一個(gè)FleQ調(diào)控鞭毛基因轉(zhuǎn)錄的簡(jiǎn)單模型。本文的第二部分主要對(duì)P aeruginosa PA01中糖苷水解酶PslG的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究。前面提到,胞外多糖對(duì)細(xì)菌生物被膜的形成十分重要。銅綠假單胞菌主要產(chǎn)生三種胞外多糖：alginate、Pel和P sl。 Psl是PAO1胞外基質(zhì)的主要成分,對(duì)生物被膜的形成及抗生素抗性起到了關(guān)鍵性的作用。Ps1由五糖重復(fù)單元組成,包括D-甘露糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖。Ps1可以在生物被膜細(xì)胞表面形成螺旋的網(wǎng)狀物,將細(xì)胞包裹其中,進(jìn)而在生物被膜形成過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與表面之間的交流。P. aeruginosa中Ps1的合成和分泌依賴于12種psl基因(PA2231-PA2242)。 PslG (PA2237)位于周質(zhì)空間,對(duì)Psl合成是必需的。將pslG基因敲除后菌株不能合成Psl,并且生物膜的形成量大大降低,但其具體功能尚不清楚。有趣的是,通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列BLAST以及之前所報(bào)道的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)都顯示PslG屬于CAZy糖苷水解酶第39家族。通過(guò)與中國(guó)科學(xué)院微生物所馬旅雁研究員課題組合作研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)菌體內(nèi)過(guò)表達(dá)PslG以及向培養(yǎng)基中外源添加PslG蛋白,均可以抑制PAO1生物被膜的形成,并且可以水解已經(jīng)成熟的生物被膜。免疫印跡及多糖水解分析實(shí)驗(yàn)顯示,PslG可以直接降解Psl。為了研究其分子機(jī)制,我們解析了PslG的晶體結(jié)構(gòu),確定了催化結(jié)構(gòu)域、多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM)以及關(guān)鍵的催化氨基酸(Glu165, Glu276),并對(duì)參與活性中心構(gòu)成的其它氨基酸進(jìn)行了分析。結(jié)構(gòu)分析顯示PslG具有典型的糖苷內(nèi)切酶的特征。我們通過(guò)Molecular Docking構(gòu)建了PslG與Ps1四糖的作用模型,并通過(guò)結(jié)構(gòu)分析推測(cè)PslG催化水解β-D-Man和α-L-Rha之間的1-3糖苷鍵。除此之外,分子篩層析實(shí)驗(yàn)顯示,PslG在superdex 200上的出峰位置明顯滯后,間接地證明了CBM結(jié)構(gòu)域可能參與多糖結(jié)合。綜合來(lái)講,本文主要研究了兩種銅綠假單胞菌生物被膜相關(guān)蛋白FleQ和PslG的結(jié)構(gòu)及功能,初步闡釋了它們的作用機(jī)制。FleQ調(diào)控鞭毛和生物被膜的合成；PslG可以抑制并水解生物被膜。鑒于鞭毛和生物被膜在銅綠假單胞菌致病性中的重要作用,我們的研究將對(duì)這類細(xì)菌感染的治療提供非常有力的幫助。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2778516