發(fā)布時間：2020-08-01 12:34

【摘要】：目的:環(huán)境毒素魚藤酮能夠引發(fā)α-突觸核蛋白(α-synuclein)在中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺神經(jīng)元中蓄積、導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元發(fā)生退行性病變,其分子機制尚不完全明確;我們證明魚藤酮能夠通過損傷溶酶體,引起自噬流阻滯,蛋白降解障礙,α-synuclein在中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺神經(jīng)元內(nèi)堆積后導(dǎo)致帕金森癥發(fā)病。方法:我們在長期魚藤酮皮下注射Lewis大鼠制備的帕金森大鼠模型和多巴胺能細胞系PC12細胞魚藤酮體外干預(yù)模型基礎(chǔ)上,觀察魚藤酮引起的α-synuclein自噬降解障礙并探討其作用機制。在體內(nèi)模型中,我們分別通過免疫組織化學(xué)法觀察大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量,免疫印跡法檢測紋狀體和腹側(cè)中腦區(qū)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)含量,動物自發(fā)活動儀進行行為學(xué)研究,明確帕金森癥動物造模成功。然后通過形態(tài)學(xué)檢測大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺神經(jīng)元內(nèi)α-synuclein聚集體,電鏡觀察自噬體數(shù)量,腹側(cè)中腦取材后PCR法檢測α-synuclein的m RNA水平,免疫印跡法檢測α-synuclein以及自噬標記物microtubule-associated protein 1 light chain 3-II(LC3-II),Beclin 1,和p62等蛋白水平。免疫熒光法雙標TH/α-synuclein,TH/LAMP2,TH/cathepsin D。在體外模型中,我們使用CCK8法檢測PC12細胞活力確定魚藤酮損傷濃度,同上檢測魚藤酮干預(yù)后α-synuclein、LC3-II、Beclin 1、p62等蛋白水平。使用自噬阻滯劑Bafilomycin A1判斷魚藤酮干預(yù)后自噬流通暢與否。免疫熒光法雙標LAMP2/cathepsin D,提純?nèi)苊阁w后進行孵育,收取上清液后用免疫印跡法檢測溶酶體酶cathepsin D的漏出情況。同時使用N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D-glucosaminidase,NAG)檢測試劑盒進一步明確溶酶體膜通透性改變情況。驗證自噬激動劑海藻糖對環(huán)境毒素魚藤酮導(dǎo)致的神經(jīng)細胞毒性的保護作用,并且檢測海藻糖使用后魚藤酮體內(nèi)外帕金森癥模型轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)、LC3-II和LAMP2蛋白表達量,免疫熒光法檢測外源性GFP-LC3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后點狀聚集體變化情況和Lyso Tracker觀察溶酶體熒光強度,分別使用使用質(zhì)核分離試劑盒和免疫熒光法觀察自噬激動劑海藻糖使用后TFEB蛋白入核現(xiàn)象。結(jié)果:環(huán)境毒素魚藤酮干預(yù)后能夠?qū)е翷ewis大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞丟失,伴隨自發(fā)活動明顯降低。發(fā)生神經(jīng)退行性病變的多巴胺神經(jīng)元內(nèi)有大量α-synuclein蓄積,同時自噬體數(shù)量顯著增多,溶酶體內(nèi)水解酶cathepsin D從溶酶體內(nèi)漏出到胞漿中。在體外模型中,魚藤酮能夠明顯上調(diào)α-synuclein、LC3-II、Beclin 1、p62等蛋白水平,提示自噬流阻滯。魚藤酮導(dǎo)致PC12細胞溶酶體膜通透性增高,使其中水解酶大量釋放到胞漿中,這種損傷作用作用可以被活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除劑4,5-dihydroxyl-1,3-benzededisulfonic acid(tiron)所緩解。自噬激動劑海藻糖能夠引發(fā)TFEB發(fā)生核轉(zhuǎn)位,恢復(fù)溶酶體功能,加速自噬體的清除,降解α-synuclein;海藻糖對魚藤酮體內(nèi)外模型具有保護作用。結(jié)論:我們發(fā)現(xiàn)溶酶體損傷是環(huán)境毒素魚藤酮導(dǎo)致帕金森癥的機制之一,保護溶酶體功能將成為抗帕金森癥藥物研發(fā)的重要靶點。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5

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本文編號：2777465