【摘要】：背景和目的腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome, IB S)是消化系統(tǒng)發(fā)病率較高的慢性功能性胃腸疾病。其主要癥狀為腹痛和腹部不適,并伴有排便習(xí)慣和糞便性狀的改變,而經(jīng)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)輔助檢查卻無(wú)器質(zhì)性病變。腹痛是而腸易激綜合征患者的主要主訴癥狀之一,其發(fā)生的嚴(yán)重程度及頻率顯著影響IBS患者的生活質(zhì)量。目前IBS腹痛發(fā)生的機(jī)制尚未完全明確,大量研究提示內(nèi)臟敏感性增高是IBS腹痛發(fā)生的重要病理生理機(jī)制之一。目前認(rèn)為IBS內(nèi)臟高敏感的發(fā)生可能包含了中樞致敏和外周致敏兩大不同的病理生理過(guò)程,他們可能分別或共同參與了IBS不同的發(fā)病起始,然而,我們對(duì)IBS中樞或外周致敏的誘發(fā)機(jī)制仍然知之甚少。近年來(lái),一系列研究發(fā)現(xiàn)IBS患者結(jié)腸粘膜組織成分存在明顯改變,并與IBS內(nèi)臟高敏感密切相關(guān),這些異常改變包括局部免疫的激活引起的腸嗜鉻細(xì)胞釋放5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)增多以及肥大細(xì)胞激活釋放組胺增多等。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族的主要成員之一,廣泛分布于中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng),在神經(jīng)元分化及發(fā)育成熟過(guò)程中起重要作用。大量研究表明BDNF同時(shí)也是一種疼痛調(diào)節(jié)介質(zhì),其在不同病理生理?xiàng)l件下的異常表達(dá)升高參與了諸多病理性疼痛的起始和維持。研究發(fā)現(xiàn),除在中樞表達(dá)外,人腸道也表達(dá)BDNF,我們之前發(fā)表的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)IBS患者,主要是腹瀉型IBS (diarrhoea-predominant IBS, IBS-D)患者,結(jié)腸粘膜上皮及固有層BDNF表達(dá)顯著高于正常對(duì)照,并與患者腹痛程度和頻率顯著相關(guān),提示腸道BDNF在IBS患者腹痛發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用。然而,IBS患者結(jié)腸BDNF高表達(dá)的起始因素以及BDNF參與IBS腹痛發(fā)生的分子機(jī)制目前仍不清楚。多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)IBS-D患者糞便絲氨酸蛋白酶活性顯著升高,并且通過(guò)激活蛋白酶活化受體-2 (protease activated receptor-2, PAR-2)增加IBS-D腸道通透性,繼而參與調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性。而PAR-2受體的激活同時(shí)參與上皮細(xì)胞分泌功能的調(diào)節(jié),因此,IBS-D患者結(jié)腸上皮表達(dá)增高的BDNF是否歸因于其腸內(nèi)容物中升高的絲氨酸蛋白酶活性及其繼而激活的PAR-2信號(hào)通路,值得我們深入探討。腸膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)(Enteoglial cells, EGC)是整個(gè)腸道獨(dú)有的特殊網(wǎng)絡(luò),越來(lái)越多的證據(jù)提示EGC在腸道穩(wěn)態(tài)包括腸道動(dòng)力,分泌,吸收和腸屏障功能均有重要作用。而EGC與中樞星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)同樣的激活標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP),鑒于星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生中的顯著作用,IBS患者腸上皮釋放增多的BDNF,是否可通過(guò)影響EGC網(wǎng)絡(luò),進(jìn)而引起腸道感覺(jué)信息的傳遞異常呢?基于以上理論和發(fā)現(xiàn),本研究分三個(gè)部分對(duì)以上問(wèn)題進(jìn)行探討,第一部分研究IBS患者結(jié)腸BDNF過(guò)表達(dá)可能的起始機(jī)制,包括：1.檢測(cè)IBS-D患者結(jié)腸內(nèi)容物上清液刺激后人結(jié)腸上皮細(xì)胞BDNF的表達(dá)改變；2.探討IBS-D患者結(jié)腸內(nèi)容物上清提取液誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞BDNF的表達(dá)的分子機(jī)制。第二、三部分探討腸粘膜BDNF過(guò)表達(dá)介導(dǎo)IBS腹痛發(fā)生的分子機(jī)制,研究包括：1.探討IBS患者腸粘膜中BDNF及其受體Tropomyosin receptor kinase B (TrkB)表達(dá)的改變,EGC網(wǎng)絡(luò)相關(guān)標(biāo)記物和分泌因子的改變,并探討這些可能存在的改變與IBS腹痛癥狀的相關(guān)性(第二部分)。2.應(yīng)用IBS-D患者糞便上清誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)臟高敏感模型,以及EGC功能障礙小鼠模型,并借助于BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠對(duì)比,探討B(tài)DNF與EGC激活的關(guān)系以及EGC網(wǎng)絡(luò)改變?cè)趦?nèi)臟高敏感發(fā)生中的直接作用。最后通過(guò)體外EGC培養(yǎng)和腸系膜神經(jīng)放電實(shí)驗(yàn),探究BDNF對(duì)EGC作用的相關(guān)分子機(jī)制,以及BDNF自身和EGC激活分別對(duì)腸感覺(jué)傳入神經(jīng)興奮性和機(jī)械敏感性的直接作用(第三部分)。方法第一部分依據(jù)功能性胃腸病羅馬III標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)納入22例IBS-D患者和17例正常對(duì)照者,收集每位受試者新鮮糞便,經(jīng)處理后提取上清液(Fecal supernatants, FSN),應(yīng)用azo-casein法測(cè)定上清液蛋白水解酶活力。應(yīng)用絲氨酸蛋白酶抑制劑驗(yàn)證IBS-D FSN升高的蛋白酶活性依是否賴于絲氨酸蛋白酶。FSN分別刺激6小時(shí)和24小時(shí)提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BDNF和PAR-2 mRNA表達(dá)；同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清,應(yīng)用ELISA測(cè)定上清BDNF濃度。提取總蛋白,Western blotting檢測(cè)PAR-2表達(dá)。應(yīng)用人結(jié)腸腺癌來(lái)源的上皮細(xì)胞系Caco-2行體外培養(yǎng),應(yīng)用靶向PAR-2基因的小干擾RNA(siRNA)沉默Caco-2細(xì)胞PAR-2基因,并在接受IBS-D FSN和對(duì)照FSN刺激24小時(shí)后檢測(cè)PAR-2和BDNF蛋白的表達(dá)。結(jié)合PAR-2拮抗劑,p38 MAPK和NF-κB抑制劑,檢測(cè)IBS-D FSN對(duì)以上兩種信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。選用野生雄性C57BL/6小鼠,應(yīng)用IBS-D FSN結(jié)腸灌注誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸高敏感。結(jié)合BDNF拮抗劑,絲氨酸蛋白酶抑制劑和PAR-2拮抗劑,通過(guò)結(jié)直腸擴(kuò)張(Colorectal distention, CRD)和腹壁肌電實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠內(nèi)臟敏感性變化。收集灌注部位的小鼠結(jié)腸組織,Western blotting和免疫組化染色檢測(cè)BDNF的表達(dá)和分布。第二部分根據(jù)羅馬III標(biāo)準(zhǔn)入選IBS患者和正常對(duì)照者,每位IBS患者完成一份腸道功能評(píng)分量表,進(jìn)行腹痛嚴(yán)重程度和頻率評(píng)分。收取IBS和正常對(duì)照者糞便,提取上清。每位受試者接受結(jié)腸鏡檢查,并在直腸乙狀結(jié)腸交界處收取6塊活檢標(biāo)本,2塊用于常規(guī)組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué),2塊用于western blotting,2塊用于透射電鏡檢查。應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)活檢標(biāo)本結(jié)腸粘膜中BDNF和GFAP表達(dá),熒光雙標(biāo)檢測(cè)TrkB受體和P物質(zhì)(Substance P, SP)在EGC和腸神經(jīng)纖維中的表達(dá)。Western blotting進(jìn)一步定量BDNF, GFAP和TrkB在腸粘膜中的表達(dá),并分析與腹痛評(píng)分的相關(guān)性。應(yīng)用透射電鏡觀察EGC形態(tài)學(xué)改變,并定量EGC中異染色質(zhì),線粒體,糖原顆粒,高爾基體和核糖體數(shù)目的改變。第三部分應(yīng)用IBS-D患者糞便上清以及BDNF+/-C57BL/6小鼠和同窩出生BDNF+/+野生小鼠構(gòu)建模擬IBS的內(nèi)臟高敏感模型。結(jié)合絲氨酸蛋白酶抑制劑,BDNF拮抗劑和EGC代謝抑制劑,通過(guò)CRD和腹壁肌電實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠內(nèi)臟敏感性檢測(cè)變化。收集灌注部位結(jié)腸組織,應(yīng)用western blotting和免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)腸粘膜BDNF, GFAP, TrkB和SP的表達(dá)。應(yīng)用人重組BDNF (r-HuBDNF)體外刺激大鼠腸膠質(zhì)細(xì)胞系,結(jié)合PLC-γ1抑制劑和TrkB拮抗劑進(jìn)一步檢測(cè)TrkB-PLCγ1信號(hào)通路是否參與BDNF對(duì)EGC的激活,以及EGC激活后SP表達(dá)的改變。應(yīng)用大鼠空腸腸系膜神經(jīng)放電實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EGC培養(yǎng)液上清和r-HuBDNF對(duì)腸系膜傳入神經(jīng)興奮性放電和機(jī)械敏感性的影響,進(jìn)一步驗(yàn)證EGC激活和BDNF對(duì)腸道感覺(jué)傳入神經(jīng)興奮性和敏感性的直接作用。結(jié)果第一部分1.IBS-D患者糞便上清液中絲氨酸蛋白酶活性明顯升高IBS-D FSN總蛋白酶活性為1461±143.1 U/mg蛋白,顯著高于正常對(duì)照者(438.6 ± 70.2 U/mg蛋白)。應(yīng)用絲氨酸蛋白酶抑制劑FUT-175預(yù)先孵育IBS-DFSN則可顯著抑制其升高的總蛋白酶活性。此結(jié)果證實(shí)IBS-D患者糞便上清中升高的蛋白酶活性主要依賴于絲氨酸蛋白酶。2. IBS-D患者糞便上清誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞BDNF mRNA和蛋白表達(dá)升高Caco-2細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)在IBS-D FSN刺激后顯著升高。而FUT-175預(yù)處理的IBS-D FSN組BDNF mRNA表達(dá)明顯受到抑制。與mRNA結(jié)果一致,ELISA檢測(cè)BDNF蛋白表達(dá)在IBS-D FSN刺激后同樣顯著升高,FUT-175則同樣明顯抑制IBS-D FSN對(duì)BDNF蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用。3.PAR-2基因沉默顯著抑制IBS-D糞便上清對(duì)Caco-2細(xì)胞BDNF表達(dá)的誘導(dǎo)作用PAR-2受體在IBS-D FSN刺激后表達(dá)顯著高于對(duì)照FSN組,為進(jìn)一步探討PAR-2受體激活是否參與IBS-D FSN對(duì)BDNF表達(dá)的誘導(dǎo)過(guò)程,我們應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)RNA干擾瞬時(shí)沉默PAR-2基因在Caco-2的表達(dá)。結(jié)果顯示PAR-2基因沉默對(duì)Caco-2 BDNF的基礎(chǔ)表達(dá)無(wú)明顯影響,但卻顯著抑制IBS-D FSN對(duì)Caco-2細(xì)胞BDNF表達(dá)的上調(diào)作用。4. p38 MAPK通路蛋白參與IBS-D糞便上清液誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞BDNF過(guò)表達(dá)為進(jìn)一步研究PAR-2介導(dǎo)BDNF表達(dá)的下游通路,我們檢測(cè)了MAPK p38和NF-κB p65兩個(gè)PAR-2受體下游通路蛋白。結(jié)果顯示IBS-D FSN能夠快速誘導(dǎo)p38MAPK磷酸化增加,但對(duì)p65蛋白無(wú)明顯影響。PAR-2抑制劑ENMD-1068可阻斷IBS-D FSN對(duì)p38磷酸化的誘導(dǎo)。p38 MAPK抑制劑SB203580可阻斷IBS-DFSN對(duì)Caco-2細(xì)胞BDNF蛋白的上調(diào),但NF-κB抑制劑PDTC則無(wú)此作用。5.結(jié)直腸灌注IBS-D糞便上清液可誘導(dǎo)C57小鼠結(jié)腸高敏感,其作用依賴于結(jié)腸PAR-2激活和BDNF的過(guò)表達(dá)Western blotting結(jié)果顯示,與對(duì)照FSN相比,結(jié)腸灌注IBS-D FSN可顯著上調(diào)小鼠結(jié)腸上皮BDNF蛋白的表達(dá),且此作用可被FUT-175和ENMD-1068抑制。免疫組化驗(yàn)證了Western blotting結(jié)果,顯示上調(diào)的BDNF主要分布于結(jié)腸上皮和粘膜。功能上,腹壁肌電記錄顯示結(jié)直腸灌注生理鹽水和對(duì)照FSN對(duì)小鼠結(jié)腸敏感性沒(méi)有明顯影響,IBS-D FSN可則顯著增強(qiáng)小鼠對(duì)CRD的腹壁肌電反應(yīng)。阻斷BDNF或PAR-2,以及消除IBS-D FSN絲氨酸蛋白酶活力均顯著抑制IBS-D FSN對(duì)結(jié)腸高敏感的誘導(dǎo)作用。第二部分1.研究對(duì)象基本情況連續(xù)納入符合羅馬III診斷標(biāo)準(zhǔn)的IBS患者30例和正常對(duì)照者30例。IBS患者腹痛程度和腹痛頻率評(píng)分均顯著高于對(duì)照組,IBS亞型之間無(wú)明顯差異。IBS-D患者糞便上清(IBS-DFSN)絲氨酸蛋白酶活力為明顯高于正常對(duì)照(median (IQR) 1521(905.3-1983) U/mg蛋白vs.465 (264.3-708.0) U/mg蛋白；P0.0001)。絲氨酸蛋白酶抑制劑抑肽酶(aprotinin)顯著降低IBS-D FSN絲氨酸蛋白酶活力(245(109.8-413.5)U/mg蛋白；P0.001)。而IBS-C FSN絲氨酸蛋白酶活力(455(253-905.5)U/mg蛋白)與對(duì)照無(wú)明顯差異。2. BDNF及其受體TrkB與腸膠質(zhì)細(xì)胞(EGC)在腸粘膜分布緊密相關(guān)免疫組化染色顯示結(jié)腸BDNF主要分布于結(jié)腸上皮細(xì)胞和粘膜固有層間質(zhì)細(xì)胞,EGC標(biāo)記物GFAP主要分布于上皮下的粘膜固有層間質(zhì)。免疫熒光雙標(biāo)顯示TrkB受體和GFAP存在共位表達(dá),提示EGC表達(dá)TrkB受體；TrkB受體和神經(jīng)纖維標(biāo)記物PGP9.5也存在部分共位表達(dá),表明神經(jīng)纖維也表達(dá)TrkB受體。GFAP和PGP9.5免疫熒光雙染顯示GFAP與PGP9.5緊密相鄰,并行,部分存在直接接觸,表明EGC與腸粘膜神經(jīng)纖維空間分布關(guān)系緊密,為二者可能存在相互作用提供了解剖學(xué)基礎(chǔ)。3.IBS患者結(jié)腸粘膜BDNF, TrkB, GFAP表達(dá)升高在本研究群體中,免疫組化和western blotting再次驗(yàn)證了IBS患者結(jié)腸BDNF表達(dá)顯著高于對(duì)照者,與我們之前發(fā)表另一IBS研究群體的研究結(jié)果一致。Western blotting顯示IBS結(jié)腸粘膜總GFAP和TrkB蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照。免疫熒光雙標(biāo)統(tǒng)計(jì)顯示EGC特異表達(dá)的TrkB也顯著高于對(duì)照組。而IBS-D組和IBS-C組這些蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異。以上數(shù)據(jù)提示IBS患者增高的腸粘膜BDNF可能能夠通過(guò)激活EGC發(fā)揮致痛作用。4.IBS患者結(jié)腸腸膠質(zhì)細(xì)胞(EGC)伴有顯著的超微結(jié)構(gòu)改變?yōu)榱岁U明EGC在IBS是否存在異常激活,我們進(jìn)一步應(yīng)用透射電鏡對(duì)IBS患者結(jié)腸EGC進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察,評(píng)價(jià)其亞細(xì)胞水平的改變。電鏡結(jié)果顯示IBS患者EGC異染色質(zhì)明顯減少,此為轉(zhuǎn)錄激活的信號(hào)；線粒體數(shù)目明顯增多；糖原顆粒明顯增多；鏡下粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及多核糖體經(jīng)肉眼觀察也多于對(duì)照。以上數(shù)據(jù)提示IBS患者存在EGC功能異�；钴S。5.IBS患者結(jié)腸腸膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)P物質(zhì)升高我們首次在人腸粘膜中檢測(cè)SP在EGC中的表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)顯示IBS患者結(jié)腸EGC內(nèi)存在SP的表達(dá),且其表達(dá)量相比對(duì)照明顯增多。6. GFAP與SP表達(dá)與IBS腹痛評(píng)分顯著相關(guān)為進(jìn)一步分析EGC和IBS腹痛的關(guān)系,我們應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析法發(fā)現(xiàn)GFAP與SP均與IBS患者腹痛嚴(yán)重性評(píng)分和頻率評(píng)分具有顯著正相關(guān)性。第三部分1. IBS-D FSN誘導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感小鼠結(jié)腸過(guò)表達(dá)BDNF, GFAP, TrkB和SP我們選利用第二部分研究中收集的IBS-D FSN進(jìn)行小鼠結(jié)腸灌注成功建立小鼠內(nèi)臟高敏感模型后,檢測(cè)結(jié)腸BDNF, TrkB和GFAP蛋白表達(dá)。Western blotting發(fā)現(xiàn)模型組小鼠BDNF, GFAP和TrkB蛋白的表達(dá)量顯著高于對(duì)照FSN組和抑肽酶預(yù)處理的IBS-D FSN組。免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)模型組和對(duì)照組結(jié)腸粘膜總SP和EGC特異表達(dá)的SP的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照FSN組和抑肽酶預(yù)處理的IBS-DFSN組。2. BDNF基因敲除抑制IBS-D FSN對(duì)小鼠內(nèi)臟高敏感的誘導(dǎo)作用為進(jìn)一步從反面驗(yàn)證BDNF是否與EGC的激活相關(guān)以及BDNF水平降低后是否能阻斷IBS-D FSN對(duì)內(nèi)臟高敏感的誘導(dǎo),我們應(yīng)用BDNF基因敲除雜合子小鼠(BDNF+/-)作陰性對(duì)照,發(fā)現(xiàn)BDNF+/-小鼠接受IBS-D FSN結(jié)腸灌注后EMG反應(yīng)顯著低于野生小鼠。BDNF半量敲除后對(duì)小鼠基礎(chǔ)內(nèi)臟敏感性有一定影響,此影響在輕度的結(jié)腸擴(kuò)張刺激下(60 mmHg)不明顯,而在較重度(≥60 mmHg)的結(jié)腸擴(kuò)張刺激下比較明顯。以上結(jié)果提示IBS-D FSN誘導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感與BDNF表達(dá)水平密切相關(guān)。3. BDNF基因敲除抑制IBS-D FSN對(duì)小鼠結(jié)腸BDNF, GFAP, TrkB和SP表達(dá)的上調(diào)為進(jìn)一步明確結(jié)腸EGC的激活是否依賴BDNF的表達(dá),我們以BDNF+/-小鼠為對(duì)照,對(duì)比檢測(cè)IBS-D FSN和對(duì)照FSN結(jié)腸刺激后GFAP, TrkB以及SP表達(dá)的差異。Western blotting結(jié)果顯示,在BDNF+/-小鼠,IBS-D FSN刺激組和對(duì)照FSN刺激組GFAP和TrkB蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異；同時(shí),這兩組與野生小鼠對(duì)照FSN組的GFAP和TrkB蛋白表達(dá)水平也沒(méi)有顯著性差異,但卻明顯低于野生小鼠IBS-D FSN刺激組。免疫熒光雙標(biāo)染色顯示BDNF+/-小鼠IBS-D FSN刺激組和對(duì)照FSN刺激組結(jié)腸總SP和EGC特異表達(dá)的SP表達(dá)量均無(wú)明顯差異,但SP在兩刺激組EGC的表達(dá)量相比野生小鼠降低。以上結(jié)果提示EGC中GFAP以及SP的表達(dá)均依賴于BDNF的表達(dá)水平,表明EGC的激活很可能依賴BDNF相關(guān)的信號(hào)通路。4.氟代檸檬酸誘導(dǎo)的腸膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙抑制IBS-D FSN對(duì)內(nèi)臟高敏感的誘導(dǎo)及SP的表達(dá)為了進(jìn)一步驗(yàn)證EGC激活對(duì)內(nèi)臟敏感性的直接作用,我們應(yīng)用氟代檸檬酸介導(dǎo)的EGC功能障礙小鼠模型觀察其對(duì)IBS-D FSN結(jié)腸刺激的反應(yīng)變化,發(fā)現(xiàn)氟代檸檬酸顯著抑制IBS-D FSN對(duì)野生小鼠內(nèi)臟敏感性的上調(diào)作用。免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)盡管GFAP表達(dá)沒(méi)有受到明顯影響,SP在EGC的表達(dá)卻顯著減少,并且IBS-D FSN刺激無(wú)法誘導(dǎo)SP在EGC的表達(dá)增加。以上結(jié)果表明,EGC很可能通過(guò)釋放SP直接參與IBS-D FSN對(duì)小鼠內(nèi)臟高敏感的誘導(dǎo)過(guò)程。5.重組人BDNF (r-HuBDNF)體外通過(guò)TrkB-PLCγ1通路直接激活腸膠質(zhì)細(xì)胞為獲得BDNF激活EGC的直接證據(jù),我們進(jìn)一步在體外應(yīng)用EGC細(xì)胞系,研究人重組BDNF (r-HuBDNF)對(duì)大鼠腸膠質(zhì)細(xì)胞的直接作用。Western blotting顯示r-HuBDNF可顯著上調(diào)GFAP,磷酸化的PLCγ1 (p-PLCγ1), TrkB以及SP的表達(dá),BDNF競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑TrkB/Fc預(yù)處理細(xì)胞則可完全阻斷r-HuBDNF對(duì)GFAP, p-PLCγ1, TrkB以及SP的上調(diào)作用；PLCγ1抑制劑U73122可顯著抑制GFAP的表達(dá),PLCγ1的磷酸化水平,以及SP的釋放,但對(duì)TrkB蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯作用。以上數(shù)據(jù)表明BDNF可直接激活EGC表達(dá)SP,且這一過(guò)程依賴于TrkB-PLCγ1的介導(dǎo)。6. r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清而非r-HuBDNF本身可誘導(dǎo)腸系膜感覺(jué)傳入神經(jīng)的放電反應(yīng)為進(jìn)一步驗(yàn)證r-HuBDNF刺激的EGC對(duì)腸感覺(jué)傳入神經(jīng)是否具有直接興奮性或致敏作用,我們應(yīng)用r-HuBDNF刺激的EGC培養(yǎng)液上清刺激離體的大鼠空腸腸系膜神經(jīng),觀察神經(jīng)放電頻率的的變化。對(duì)照EGC培養(yǎng)液上清刺激后,神經(jīng)放電頻率與刺激前基礎(chǔ)放電率沒(méi)有明顯差異。r-HuBDNF對(duì)神經(jīng)放電沒(méi)有明顯影響,提示r-HuBDNF本身并不能誘發(fā)神經(jīng)放電反應(yīng)。r-HuBDNF (50～200 ng/ml)刺激的EGC培養(yǎng)液上清可明顯誘發(fā)神經(jīng)放電。應(yīng)用PLCγ1抑制劑U73122或BDNF競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑TrkB/Fc預(yù)處理EGC后的培養(yǎng)液上清則無(wú)法誘發(fā)腸系膜神經(jīng)放電增加。應(yīng)用SP特異性拮抗劑FK888預(yù)處理腸系膜神經(jīng)以阻斷SP受體NK1,發(fā)現(xiàn)活化的EGC培養(yǎng)液上清誘導(dǎo)神經(jīng)放電頻率相比未進(jìn)行預(yù)處理時(shí)顯著下降,但仍高于基礎(chǔ)放電水平,提示SP在EGC對(duì)感覺(jué)神經(jīng)興奮過(guò)程中起重要作用。綜合以上數(shù)據(jù),我們推斷r-HuBDNF激活的EGC可顯著增加腸系膜感覺(jué)傳入神經(jīng)的興奮性放電,并且EGC中SP的釋放在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用。7. r-HuBDNF能夠增強(qiáng)腸系膜傳入神經(jīng)的機(jī)械敏感性,且此作用可被激活的EGC協(xié)同性增強(qiáng)最后,我們進(jìn)一步探討r-HuBDNF及其激活的EGC對(duì)腸系膜神經(jīng)機(jī)械敏感性的作用。r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清對(duì)大鼠空腸腸系膜神經(jīng)的機(jī)械敏感性增強(qiáng)作用最明顯,r-HuBDNF能夠中等程度的增加腸系膜神經(jīng)的機(jī)械敏感性,但幅度小于r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清。應(yīng)用TrkB拮抗劑預(yù)處理腸系膜神經(jīng)可部分抑制r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清對(duì)機(jī)械敏感性的增強(qiáng)作用,而應(yīng)用TrkB拮抗劑和NK1拮抗劑共同預(yù)處理腸系膜神經(jīng)則可顯著抑制r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清對(duì)機(jī)械敏感性的增強(qiáng)作用。綜上,我們的研究結(jié)果表明盡管r-HuBDNF自身不能直接誘發(fā)腸系膜神經(jīng)放電,卻能夠誘導(dǎo)腸系膜傳入神經(jīng)的機(jī)械敏感性增加。激活的EGC也能夠通過(guò)釋放包括SP在內(nèi)的神經(jīng)興奮性物質(zhì)顯著增加腸系膜傳入神經(jīng)的機(jī)械敏感性,因此我們認(rèn)為r-HuBDNF和激活的EGC對(duì)腸系膜傳入神經(jīng)的機(jī)械敏感性具有協(xié)同性增加作用。結(jié)論第一部分1. IBS-D糞便上清對(duì)腸上皮細(xì)胞BDNF的基因表達(dá)具有顯著促進(jìn)作用,并通過(guò)PAR-2-p38 MAPK信號(hào)通路激活腸上皮細(xì)胞BDNF的表達(dá),且此作用依賴于糞便上清中升高的絲氨酸蛋白酶活性。2. IBS-D糞便上清可體內(nèi)誘導(dǎo)結(jié)腸高敏感,且此過(guò)程依賴于結(jié)腸上皮PAR-2受體的激活和BDNF表達(dá)增高。第二部分1.IBS患者結(jié)腸粘膜EGC可能存在激活,表現(xiàn)為GFAP表達(dá)增加以及興奮性神經(jīng)遞質(zhì)SP的表達(dá)增多。2.IBS患者結(jié)腸粘膜BDNF, EGC以及傳入神經(jīng)末梢密切相關(guān),可能存在相互作用的增強(qiáng)。3. BDNF及其相關(guān)的EGC改變與IBS患者腹痛癥狀具有正相關(guān)性。第三部分1.結(jié)腸BDNF過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)腸感覺(jué)傳入神經(jīng)的化學(xué)和機(jī)械敏感性,但本身不能誘發(fā)神經(jīng)興奮性放電。2.結(jié)腸BDNF過(guò)表達(dá)可直接激活EGC,誘導(dǎo)其釋放SP。3.激活的腸膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)釋放SP增強(qiáng)腸感覺(jué)傳入神經(jīng)的化學(xué)和機(jī)械敏感性,同時(shí)也可直接增加神經(jīng)自發(fā)放電,并和BDNF協(xié)同促進(jìn)IBS內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R574.4

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6 朱元;從內(nèi)皮—膠質(zhì)細(xì)胞信息網(wǎng)絡(luò)解析腦絡(luò)功能及通絡(luò)救腦注射液干預(yù)特征[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2012年

7 常晟;衰老對(duì)視皮層細(xì)胞的空間頻率選擇性和膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)的影響[D];安徽師范大學(xué);2010年

8 郁曉燕;外周炎癥性疼痛刺激誘導(dǎo)脊髓以上中樞膠質(zhì)細(xì)胞激活及細(xì)胞因子的表達(dá)變化[D];南通大學(xué);2007年

9 李江;寡突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析[D];華東師范大學(xué);2012年

10 張?jiān)茒?MrgC受體對(duì)嗎啡耐受誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用及機(jī)制[D];福建師范大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2772845