發(fā)布時(shí)間：2020-07-31 09:06

【摘要】：結(jié)腸癌是發(fā)達(dá)國(guó)家的常見(jiàn)惡性腫瘤,也是我國(guó)常見(jiàn)的九大惡性腫瘤之一。在過(guò)去的30多年時(shí)間里,隨著發(fā)展中國(guó)家城市化水平的進(jìn)程,包括我國(guó)在內(nèi)的多數(shù)國(guó)家或地區(qū)結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。近十年來(lái),隨著手術(shù)、放療和化療的進(jìn)步,早中期結(jié)腸癌治療效果有了明顯提升。然而手術(shù)僅對(duì)未轉(zhuǎn)移腫瘤的治療效果好,中晚期腫瘤采用放療5年生存率低于15%,采用化療5年生存率更低,這主要是由于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移�；熕幬镌跉麗盒阅[瘤細(xì)胞的同時(shí),對(duì)機(jī)體的正常細(xì)胞有不同程度的毒副作用及耐藥性。因此,從天然產(chǎn)物中尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物一直是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。地皮菜,拉丁名為Nostoc commune Vauch.,別名地耳、地踏菇、地衣、地木耳、地軟等,在我國(guó)各地都有分布。地皮菜是可以食用的一種藍(lán)藻,營(yíng)養(yǎng)豐富,含有人體所必需的八種氨基酸,蛋白質(zhì)、VC、鐵、鈣等的含量甚至超過(guò)了木耳和銀耳,具有重要的保健和醫(yī)療的重要價(jià)值。本研究以地皮菜為原料,利用生物化學(xué)技術(shù)從地皮菜蛋白粗提液中獲得了單一的抗腫瘤活性蛋白組分,經(jīng)質(zhì)譜鑒定屬于水應(yīng)激蛋白(water stress protein,WSP)家族,命名為WSP1。應(yīng)用細(xì)胞及裸鼠模型,從細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞遷移等方面,研究了WSP1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的分子機(jī)制。此外,采用重組基因工程技術(shù),將地皮菜水應(yīng)激蛋白經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化,鑒定了所獲重組蛋白(Re-WSP1)的氨基酸序列和抗腫瘤活性。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：(1)采用丙酮沉淀和硫酸銨沉淀法制備地皮菜粗蛋白,得到單一的蛋白組分。經(jīng)MALDI-TOF/MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定和基因序列分析,確定該蛋白組分為水應(yīng)激蛋白,命名為WSP 1 (water stress protein 1, WSP 1)。(2)采用MTT法分析WSP1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1、HCT116、SW480、HT29和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株FHC增殖的影響。結(jié)果表明,WSP1抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,對(duì)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞無(wú)顯著作用。分子機(jī)制研究顯示,WSP1通過(guò)下調(diào)c-Myc, cyclinD1, cyclinE1和p-Rb的表達(dá)水平,引起結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞周期在G1期阻滯,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。采用DAPI染色法和Annexin V/碘化丙啶雙染法檢測(cè)WSP1處理對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,WSP1處理后,DLD1和HCT116細(xì)胞核出現(xiàn)典型的凋亡小體,并且其早期凋亡率顯著高于對(duì)照組,表明WSP1能夠靶向誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。(3)通過(guò)檢測(cè)線粒體膜電位和caspase家族蛋白的表達(dá)量,進(jìn)一步確定了WSP1誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制。結(jié)果表明,經(jīng)WSP1處理后,促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降,DLD1細(xì)胞的線粒體膜電位顯著下降；caspase-8、caspase-9和caspase-3被顯著激活,caspases的切割底物DNA修復(fù)酶PARP降解。加入廣譜caspase抑制劑z-VAD-FAK后,WSP1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被明顯逆轉(zhuǎn)。(4)采用細(xì)胞劃痕法檢測(cè)了WSP1對(duì)DLD1和FHC細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果顯示,WSP1能夠顯著抑制結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞的遷移,而對(duì)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC無(wú)顯著影響。進(jìn)一步研究表明,WSP1首先抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,誘導(dǎo)DLD1細(xì)胞發(fā)生自噬；激活的自噬進(jìn)一步導(dǎo)致β-catenin降解及其下游效應(yīng)分子的表達(dá)改變,最終引起DLD1細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-Epithelial Transition, MET)。采用自噬的特異性抑制劑氯喹檢驗(yàn)上述結(jié)果,所得數(shù)據(jù)表明,WSP1誘導(dǎo)的自噬是WSP1抑制細(xì)胞遷移的關(guān)鍵路徑。(5)通過(guò)PCR技術(shù),從地皮菜中得到WSP1的基因,序列號(hào)為KF003026。利用重組基因工程技術(shù),將WSP1基因克隆到原核表達(dá)系統(tǒng),獲得了表達(dá)工程菌。經(jīng)親和純化濃縮獲得重組水應(yīng)激蛋白(recombinant water stress protein, Re-WSP1)。結(jié)果顯示,Re-WSP1對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用,與從地皮菜中獲得的天然水應(yīng)激蛋白具有相同的生物活性。因此,Re-WSP1的研究可以為天然水應(yīng)激蛋白抗癌藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。(6)用結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞建立了裸鼠皮下成瘤模型,通過(guò)腹腔注射的方法,定期進(jìn)行WSP1給藥處理(共6次)。結(jié)果顯示,WSP1處理裸鼠能夠顯著抑制結(jié)腸癌腫瘤的生長(zhǎng)。采用免疫組化的方法對(duì)腫瘤組織中與細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),包括Ki-67、caspase-8、caspase-9、PARP、β-catenin、E-cadherin和N-cadherin,其結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示,WSP1通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯而抑制其增殖；經(jīng)caspase依賴(lài)的途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡；通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制β-catenin介導(dǎo)的EMT來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移；裸鼠模型結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；重組水應(yīng)激蛋白具有與天然水應(yīng)激蛋白一樣的生物活性。因此,WSP1有可能作為一種有效的天然抗腫瘤藥物進(jìn)行深度開(kāi)發(fā)和利用。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R943

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本文編號(hào)：2776266