【摘要】：聚羥基脂肪酸酯(PHA)因具有很多優(yōu)良的性能,而被作為一種生物材料應用于醫(yī)藥等很多領域。它是一類碳源和能源的貯藏材料,它們在碳源過剩、其他大量元素(N、O、P、S)被耗盡的情況下,可以由一大類種類各異的微生物合成。PHA是由含有不同碳鏈長度的單體即3-羥基脂肪酸(3-hydroxyalkanoate, 3HA)聚合而成的。隨著目前追求“綠色聚合物”的潮流日益興盛,PHA作為一類生物可降解,具有生物兼容性的環(huán)境友好型材料,已經被用來作為石油基塑料的替代品,而引起廣泛的研究興趣。因為人們對原油價格不斷攀升越來越關注,加之石油資源的耗盡和由塑料造成的環(huán)境污染越來越嚴重,PHA的生產與合成就越來越受到研究者和工業(yè)領域的關注。目前為止,已經有超過150種的PHA單體組成得以報道。大腸桿菌作為一種模式生物,已經被廣泛用來生產各種為人類所用的高附加值產品,如生物燃料、生物材料、大宗化學品等。盡管自然條件下,大腸桿菌無法合成PHA,但是大腸桿菌仍然被認為是PHA合成的理想宿主。用于合成PHA的結構相關碳源即脂肪酸,一般說來,都是高成本,對細胞有毒性,且不溶于水的。因此,很多研究學者們都開始致力于通過整合不同生物體的基因,去發(fā)現(xiàn)利用非相關碳源合成PHA的新代謝途徑。根據單體中所含的碳原子組成數目的不同,PHA可以被分成三種主要的類型：1.短鏈長的PHA即scl-PHA,含有3-5個碳原子；2.中鏈長的PHA即mcl-PHA,含有6-14個碳原子；3.短、中鏈長單體共聚的PHA即scl-mcl PHA,含有3-14個碳原子。根據PHA的性質,可以在醫(yī)學領域發(fā)揮很大的潛能,如在整形醫(yī)學方面,可以作為螺絲,軟骨組織工程支架,骨移植的替代物。在心血管醫(yī)學方面,可以作為系統(tǒng)裝置如血管替代物、心臟瓣膜、心血管支架、心房和心包間隔的修復補丁。在創(chuàng)傷管理方面,可以用作皮膚的替代物、手術縫合線、醫(yī)用敷料、隔離劑等。除上述一系列功用之外,PHA還可以作為泌尿支架、納米或微球用以控制藥物的傳遞。既然PHA具有這么廣泛而重要的應用,因此我們更要構建新的PHA高效合成平臺,使其能夠利用廉價碳源高產含不同鏈長、不同類型單體的PHA,以適應不同應用領域的需求。傳統(tǒng)的scl-PHA如PHB生產應用的是三步法,產量較高,已經用于大規(guī)模的工業(yè)化生產。而mcl-PHA的生產主要是通過脂肪酸p-氧化和脂肪酸從頭合成途徑實現(xiàn)的。這兩個途徑分別有自己的合成缺陷,脂肪酸p-氧化途徑是以脂肪酸為碳源來合成PHA。而脂肪酸是一種較昂貴的碳源且對微生物細胞有毒害作用,因此利用該途徑合成PHA具有很大的限制。而脂肪酸從頭合成途徑雖然是利用碳水化合物為碳源生產PHA,但是細胞內積累的PHA含量較低�；谏鲜龅脑�,迫切需要構建一個利用廉價、不相關碳源高效生產PHA的平臺,從而提供充足的(R)-3-羥�；�-CoA底物。本研究著眼于解決上述問題,在重組大腸桿菌中構建了逆向脂肪酸β-氧化循環(huán)中所需酶的過表達質粒,試圖直接利用葡萄糖為碳源,通過構建的逆向脂肪酸β-氧化循環(huán),合成含有不同單體的mcl-PHA共聚物。當在單敲除硫酯酶基因的菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加30gl-1葡萄糖時,敲掉tesB基因的菌株合成的mcl-PHA含量最高,約占細胞干重的4.01%；敲除yciA基因的菌株次之,約占細胞干重的2.04%；敲除tesA基因的菌株合成的mcl-PHA含量最低。同時,我們嘗試利用其它廉價、非相關碳源如木糖進行搖瓶發(fā)酵試驗。結果表明,以30gl-1木糖為唯一碳源時,三種單敲除硫酯酶基因的菌株在轉入質粒pQQ05后,均能合成mcl-PHA,產量最高為2.33 wt%,但低于相應菌株以葡萄糖為碳源時的含量。另外,因為在出發(fā)菌株的基礎上,我們敲除了編碼大腸桿菌葡萄糖特異的PTS系統(tǒng)的關鍵酶即酶IIBC的組分基因ptsG,所以解除了大腸桿菌中的碳源代謝阻遏現(xiàn)象,使得葡萄糖和木糖可以同時被利用。因此,我們又在培養(yǎng)基中同時添加15gl-1葡萄糖和15gl-1木糖作為碳源,在三種單敲除硫酯酶基因的菌株中轉入質粒pQQ05進行搖瓶發(fā)酵試驗,結果表明三種單敲除硫酯酶基因的菌株均能合成mcl-PHA聚合物,且產量均高于單獨利用木糖為碳源的mcl-PHA合成量。為了進一步提高產量,本研究在重組大腸桿菌中同時敲除了兩個硫酯酶基因,得到雙敲除菌株。在LZ05(△tesB△yciA)中轉入質粒pQQ05, mcl-PHA含量達到6.62 wt%,在LZ06(AtesBAtesA)中轉入相同質粒,mcl-PHA含量達到6.28wt%,而在LZ07(AtesAAyciA)中轉入pQQ05積累的mcl-PHA含量最低,約占細胞干重的5.07%。三種菌的生長狀況良好,細胞干重均在6gl-1以上。為了得到既含短鏈單體又含中鏈單體的PHA即scl-mcl PHA,我們用來自Pseudomonas stutzeri 1317的低底物特異性的PHA聚合酶-PhaC2Ps替換合成mcl-PHA的來自Pseudomonas aeruginosa PAO1的PHA聚合酶-PhaC2Pa,構建了pQQ06質粒。在菌株LZ05中轉入pQQ06后,在添加30gl-1的葡萄糖的情況下,能夠合成占細胞干重約12.10%的scl-mcl PHA,其中3HB占21.18 mo1%和中鏈單體占78.82 mo1%。該生產途徑可以在經過優(yōu)化之后用于工業(yè)化的大規(guī)模生產。上述所有合成的PHA都只是含有偶數鏈單體的PHA,且已經顯示出理想的物理和機械性能,如果在其中增加奇數鏈單體的組分能夠賦予該種生物材料更高的強度和柔韌性,使其更具有新穎性和實用性。鑒于此,就特別需要構建一個高效的PHA生物合成途徑,使其能合成含奇數鏈單體mcl-PHA所需的相應奇數鏈(R)-3-羥�；�-CoA前體。迄今為止,還沒有利用葡萄糖和丙酸在大腸桿菌中積累含有不同長度奇數鏈單體的mcl-PHA的報道出現(xiàn)�；谶@個原因,利用廉價碳源,有功能的逆向脂肪酸p-氧化途徑就被用來提供兩個碳原子延伸的�；�-CoA前體來合成不同奇數鏈長的(R)-3-羥�；�-CoA,從而改變僅能添加相關碳源-奇數碳脂肪酸生產奇數鏈前體的局面。在本研究中,PHA生產的代謝途徑包括產生偶數鏈單體和奇數鏈單體的兩個平行的模塊。我們構建了一個能夠利用葡萄糖和丙酸產生從C7到C13奇數鏈單體的mcl-PHA生產途徑。為了提供奇數鏈單體的前體,在本研究中又克隆了來自R. eutropha H16的prpP、prpE和pct基因以及來自E. coli MG1655的aCs基因。將PCR擴增得到的上述4個基因與載體pBBR1MCS2連接,構建了四個質粒,即pZQ01, pZQ02, pZQ03和pZQ04。在構建奇數鏈前體供給的工程化途徑中,可以通過丙酸透過酶(PrpP)攝取丙酸。同時,丙酸也可以直接由丙酰-CoA合成酶(PrpE/Acs)激活或通過丙酰-CoA轉移酶(Pct)的作用將3-羥基戊酰-CoA單元插入到延伸的聚合物鏈中,最后再由從P. aeruginosa PAO1中克隆的編碼PHA合成酶的vhaC2Pa將單體聚合生成既含有奇數鏈單體又含有偶數鏈單體的mcl-PHA.為了分析基因prpP, acs, prpE和pct對mcl-PHA生產中奇數鏈單體含量大小的作用,本研究分別共轉化質粒pQQ05和pZQ01,pQQ05和pZQ02, pQQ05和pZQ03,pQQ05和pZQ04進入改造的大腸桿菌菌株LZ05中。之所以使用菌株LZ05,是因為其產生偶數鏈mcl-PHA的含量最高。搖瓶發(fā)酵實驗是在30℃,250 rpm的轉速條件下,加入30gl-1葡萄糖和1.5gl-1丙酸到轉化上述組合質粒的重組菌株LZ05培養(yǎng)基中,結果發(fā)現(xiàn)都能夠積累含有偶數和奇數鏈單體的mcl-PHA。與其他三個組合的質粒進行比較發(fā)現(xiàn),菌株LZ05含pQQ05和pZQ03積累mcl-PHA的含量最高。此外,工程化構建的含有質粒pQQ05和pZQ01的菌株LZ05合成了占細胞干重大約3.21%的mcl-PHA,而且該菌株含有高達11.24 mol%的最高奇數鏈mcl-PHA單體產量,其中3-羥基庚酸(3HHp)單體含量約占mcl-PHA的6.46 mmol%。這些結果表明,基因prpP, acs, prpE和pct對mcl-PHA的產量具有不同的影響。根據上述實驗結果,該菌株仍然沒有足夠的分子起始奇數鏈單體的形成。為了提高重組大腸桿菌中mcl-PHA的產量和擁有更多的奇數鏈單體,我們通過構建質粒pZQ05, pZQ06和pZQ07,重建了mcl-PHA的生物合成途徑。由于過表達prpP時獲得了最高含量的奇數鏈單體,所以在上述質粒中,prpP和acs,prpP和prpE, prpP和pct兩兩基因同時被分別過表達。然后,它們都是與質粒pQQ05共轉化到菌株LZ05中,形成LZ05(pQQ05, pZQ05), LZ05(pQQ05, pZQ06)和LZ05(pQQ05, pZQ07)。培養(yǎng)這些菌株之后發(fā)現(xiàn),它們表現(xiàn)出了不同的生長現(xiàn)象且合成了不同含量的mcl-PHA.在菌株LZ05中共轉入雙質粒pQQ05和pZQ05時,細胞干重最高可達6.90 gl-1,比用prpP或aCs單基因過表達時的菌株高。然而,當LZ05共轉入雙質粒pQQ05和pZQ06(或pZQ07)時的細胞干重只達到6.69 gl-1(或6.31 gl-1)。這些結果表明,prpP和aCs的過表達有利于細胞生長。至于mcl-PHA的含量,上述菌株各有不同。LZ05(pQQ05, pZQ06)積累了占細胞干重4.96%的mcl-PHA聚合物,是在上述三種菌株中最高的。然而,在LZ05(pQQ05, pZQ06)中奇數鏈組分約占10.98%的摩爾百分含量,比LZ05(pQQ05, pZQ01)低。為了進一步提高產量,我們又在LZ05菌株中敲除了poxB和pflB基因,構建了LZ08菌株。將pQQ05和pZQ06質粒轉入LZ08,經搖瓶發(fā)酵、GC檢測,發(fā)現(xiàn)該重組菌株能夠以30gl-1葡萄糖和2gl-1丙酸為碳源,積累約6.23 wt%的mcl-PHA,其中奇數鏈單體含量占20.03 mol%。這是迄今為止,首次以葡萄糖和丙酸為碳源合成含有奇數鏈和偶數鏈單體的mcl-PHA的報道。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

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1 孫素琴,周群,候偉俊,吳瓊,陳國強;紅外光譜法動態(tài)跟蹤聚羥基脂肪酸酯(PHAs)的熱變性過程[J];光譜學與光譜分析;2000年05期

本文編號：2771341