發(fā)布時(shí)間：2020-07-24 06:44

【摘要】：眾所周知直接的輻射暴露會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性變,但對(duì)于輻射的旁效應(yīng)與神經(jīng)毒性之間的關(guān)系尚未研究清楚,需要詳細(xì)的機(jī)制研究。體內(nèi)和體外研究都表明,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質(zhì)細(xì)胞可以保護(hù)神經(jīng)元在應(yīng)激條件下不受損傷。在神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下,非直接的輻射暴露對(duì)神經(jīng)元的調(diào)控,以及對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)作用的影響都有待研究。因此,本課題立意于評(píng)估輻射的非直接效應(yīng)對(duì)于神經(jīng)元退行性變的影響,以及在此過程中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。同時(shí),我們也對(duì)輻射后的細(xì)胞釋放出的因子對(duì)附近未受到直接輻射的細(xì)胞造成的損傷進(jìn)行了研究。我們預(yù)測(cè)輻射的旁效應(yīng)可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生并誘導(dǎo)DNA損傷最終導(dǎo)致SH-SY5Y神經(jīng)元凋亡。另外,共培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞U87可能通過降低氧化應(yīng)激和凋亡來抑制輻射的旁效應(yīng)導(dǎo)致SH-SY5Y神經(jīng)元受到的毒性作用。最后,我們用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法檢測(cè)了輻射后的細(xì)胞的培養(yǎng)液,來鑒定可以作為非輻射細(xì)胞損傷信號(hào)指示的分泌蛋白。我們使用鈷-60的γ射線作為直接的輻射源,并使用輻照細(xì)胞條件培養(yǎng)基(ICCM)來模擬輻射的間接影響。為了確定ICCM抑制神經(jīng)細(xì)胞存活的效力,我們進(jìn)行了集落形成測(cè)定和細(xì)胞活力測(cè)定。ICCM誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y的細(xì)胞凋亡情況通過TUNEL法和Annexin V/PI進(jìn)行了測(cè)定。氧化應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子的濃度的水平通過ELISA法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。直接和間接輻射暴露后關(guān)鍵凋亡蛋白的表達(dá)通過免疫印跡法進(jìn)行了研究。為了評(píng)估膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)輻射的旁效應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用;在ICCM中培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞分別在有和沒有膠質(zhì)細(xì)胞U87的transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。在不同的時(shí)間點(diǎn),通過活細(xì)胞計(jì)數(shù)法,Annexin V/PI凋亡檢測(cè),細(xì)胞周期檢測(cè),Fas受體的m RNA水平檢測(cè)(q RT-PCR),免疫印跡法和ELISA法對(duì)神經(jīng)元SH-SY5Y細(xì)胞在ICCM暴露下有和沒有與U87膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行了分析。同時(shí),也進(jìn)行了二維色譜和串聯(lián)質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)自下而上的(Bottom-up)分析研究。第一部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示神經(jīng)元SH-SY5Y細(xì)胞中ICCM抑制細(xì)胞存活,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,是時(shí)間和劑量依賴的。此外,在神經(jīng)元SH-SY5Y細(xì)胞中,ICCM顯著刺激釋放細(xì)胞炎癥因子,如腫瘤壞死因子TNF-α(P0.01),白細(xì)胞介素-1(IL-1,P0.001),和白細(xì)胞介素-6(IL-6,P0.001),提升氧化應(yīng)激的水平(MDA,P0.01)。上調(diào)關(guān)鍵凋亡蛋白的表達(dá),如,Bax蛋白,Bid蛋白,細(xì)胞色素C,caspase-8和caspase-3,證實(shí)了ICCM對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性。我們的研究顯示,ICCM會(huì)引起氧化應(yīng)激顯著增加,并降低線粒體膜電位。此外,ICCM引起SH-SY5Y細(xì)胞DNA損傷,在S期細(xì)胞周期停滯顯著增加(***P0.001),過表達(dá)P53蛋白會(huì)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)的(**P0.01)。因此增加FAS基因的表達(dá)和上調(diào)的關(guān)鍵凋亡蛋白都證明ICCM會(huì)導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡。本研究的第二部分,為了研究神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存在下輻射對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的旁作用,我們使用了Transwell共培養(yǎng)體系。我們的分析仍然集中在神經(jīng)元細(xì)胞。數(shù)據(jù)結(jié)果表明,ICCM誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在SH-SY5Y細(xì)胞與U87共培養(yǎng)后顯著降低,其進(jìn)一步幫助維持線粒體膜電位的完整性。神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y共培養(yǎng)后(與膠質(zhì)細(xì)胞U87),顯著降低ICCM誘導(dǎo)細(xì)胞的周期阻滯和P53的表達(dá)(###P0.001)。細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究顯示,在共培養(yǎng)體系中;ICCM誘導(dǎo)的FAS m RNA表達(dá)水平顯著減少(###P0.001)同時(shí)顯著降低凋亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)即FADD(###P0.001),caspase-8(###P0.001),和降解的caspase-3(###P0.001),與ICCM處理的不共培養(yǎng)的神經(jīng)元SH-SY5Y細(xì)胞相比。有趣的是,共培養(yǎng)后神經(jīng)營養(yǎng)因子,例如,GDNF,BDNF和抗氧化酶超氧化物歧化酶,谷胱甘肽水平增加,可能提示膠質(zhì)細(xì)胞U87的保護(hù)機(jī)制。本研究的第三部分是鑒定通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析ICCM中的分泌蛋白條大約被鑒定道德17%的蛋白質(zhì)為分泌顆粒和細(xì)胞外基質(zhì),而生物過程分析顯示,22.2%被鑒定到的蛋白質(zhì)參與運(yùn)輸和17.2%的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本研究提供了證據(jù)表明,輻射的旁效應(yīng)與直接輻射暴露相比對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞都有損傷效應(yīng)。因此更多的分子水平的研究來評(píng)估輻射旁效應(yīng)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)可以較少治療的不確定性與導(dǎo)致神經(jīng)退行性變的可能。
【學(xué)位授予單位】：北京理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R594.8

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2768468