【摘要】：中醫(yī)藥的應(yīng)用歷史悠久,一直在重大疾病的防治中發(fā)揮著不可替代的作用,其療效在國(guó)際范圍內(nèi)得到公認(rèn)。中藥的研發(fā)和應(yīng)用在中國(guó)、德國(guó)、日本、印度發(fā)展迅猛,例如復(fù)方丹參滴丸、金納多、小柴胡湯等中藥制劑。近年來(lái),心腦血管疾病嚴(yán)重?fù)p害人們身體健康、影響生活質(zhì)量,致死率逐年升高。腦卒中和動(dòng)脈粥樣硬化是代表性心腦血管疾病,且動(dòng)脈粥樣硬化是腦卒中的重要病理基礎(chǔ)。雖然西方醫(yī)學(xué)針對(duì)這兩類(lèi)疾病的研究較多,但是目前仍缺少有效的治療方式,針對(duì)疾病單一靶點(diǎn)、單一發(fā)病環(huán)節(jié)的藥物研發(fā)已進(jìn)入了瓶頸期。而中醫(yī)治法治則強(qiáng)調(diào)對(duì)機(jī)體的整體調(diào)控、多靶點(diǎn)多層次防治疾病,這種理念已突顯出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在中醫(yī)藥理論中,腦卒中以及動(dòng)脈粥樣硬化病變病因歸結(jié)于“血瘀”,屬于中醫(yī)血瘀證的范疇。“化瘀解毒”中藥治療血瘀證在臨床上取得了明確的效果,有副作用少、藥物依耐性低等優(yōu)勢(shì)。然而,傳統(tǒng)中藥面臨著諸如成分不明確、機(jī)制不清楚、臨床安全性等問(wèn)題,這些問(wèn)題的解決是中醫(yī)藥得到突破性發(fā)展的關(guān)鍵。已有研究證實(shí),鞣花酸和乳香酸均為“化瘀解毒”中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),兩者均是具有抗氧化活性的天然化合物并且有可能作用于Nrf2通路。乳香酸是“活血定痛”的中藥乳香的主要藥效成分,而鞣花酸廣泛存在于中藥石榴、赤芍、五倍子中。在傳統(tǒng)組方中乳香和包含鞣花酸的中藥常配伍合用。本課題中我們以血瘀證急性分型中的腦卒中和慢性分型中的動(dòng)脈粥樣硬化疾病為研究模型;作用機(jī)制探討以經(jīng)典的抗氧化應(yīng)激通路Nrf2/HO-1為主;在研究AKBA和KBA的神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)中,采用了大鼠腦缺血再灌注模型、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)、細(xì)胞缺氧缺糖(OGD)模型、免疫組織化學(xué)、免疫印跡等技術(shù)。在研究EA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和血管內(nèi)皮功能障礙的作用中,使用了兩種高血脂小鼠模型和HVUECV細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為以下兩個(gè)部分:第一部分乳香藥效物質(zhì)AKBA和KBA抗腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制研究乳香酸AKBA和KBA均是“化瘀解毒”中藥乳香樹(shù)脂提取物中主要的活性成分即藥效物質(zhì)基礎(chǔ),化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于典型的五環(huán)三萜類(lèi)化合物。本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯緼KBA和KBA作為Nrf2誘導(dǎo)劑在腦缺血再灌注(I/R)損傷保護(hù)的作用及其機(jī)制,進(jìn)行了器官、細(xì)胞、分子多層次多維度的研究。在實(shí)驗(yàn)一中,我們首先證實(shí)了AKBA在大鼠體內(nèi)腦I/R的保護(hù)作用。將所有SD大鼠隨機(jī)分為3組:Sham組,Vehicle+I/R組,以及AKBA+I/R組。建立SD大鼠大腦中動(dòng)脈阻閉(MCAO)模型。于腦缺血再灌注48 h時(shí)間點(diǎn),進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)價(jià)。而后處死大鼠,取腦對(duì)其TTC染色,計(jì)算腦梗死體積百分率。評(píng)價(jià)腦組織中氧化指標(biāo)及其N(xiāo)rf2/HO-1的蛋白表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)二體外模型中,我們進(jìn)一步研究AKBA的藥理學(xué)機(jī)制,以大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞OGD模型模擬體內(nèi)的缺血再灌注過(guò)程。以MTT法表征細(xì)胞的存活率。通過(guò)si RNA抑制的方法研究Nrf2/HO-1通路在細(xì)胞保護(hù)中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:與損傷組相比,再灌注開(kāi)始時(shí)間點(diǎn)注射給予AKBA,再灌注48 h時(shí),可顯著降低腦梗死體積百分率、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡,同時(shí)誘導(dǎo)腦組織中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)(P0.05)。在OGD模型中,AKBA同樣可以誘導(dǎo)Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá),并且保護(hù)細(xì)胞免受OGD的氧化損傷。AKBA顯著誘導(dǎo)Nrf2-ARE的結(jié)合活性(P0.05)。然而,Nrf2和HO-1的敲除可以減弱AKBA介導(dǎo)的保護(hù)作用(P0.05)。這些結(jié)果均表明,AKBA可以通過(guò)Nrf2/HO-1通路在腦I/R損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用以及抗氧化應(yīng)激作用。本課題對(duì)乳香的另外一種藥效物質(zhì)乳香酸KBA的腦保護(hù)作用也進(jìn)行了研究。在實(shí)驗(yàn)三中,體內(nèi)研究模型同樣采用的是雄性大鼠MCAO模型。在缺血再灌注1 h后給予KBA,于再灌注48 h后和損傷組進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)KBA顯著降低腦梗死體積,同時(shí)改善神經(jīng)功能評(píng)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)給予大鼠KBA,能夠有效降低MDA水平,同時(shí)改善SOD的活性(P0.05),以及調(diào)控誘導(dǎo)氧化還原通路Nrf2/HO-1。在原代培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞OGD模型中,我們同樣發(fā)現(xiàn)KBA具有抗氧化的細(xì)胞保護(hù)作用,并且通過(guò)si RNA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了Nrf2/HO-1機(jī)制在細(xì)胞保護(hù)中的重要作用。這些發(fā)現(xiàn)支持了KBA通過(guò)調(diào)控Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗I/R損傷的保護(hù)作用的結(jié)論。第二部分鞣花酸基于Nrf2/HO-1通路抗動(dòng)脈粥樣硬化及內(nèi)皮功能保護(hù)的作用本部分實(shí)驗(yàn)的目的是探討“化瘀解毒”中藥藥效物質(zhì)之一鞣花酸(EA)在防治內(nèi)皮功能障礙及動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其維持氧化還原平衡的機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,模型選擇的是WT小鼠和Apoe-/-小鼠的高脂飲食模型進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià),實(shí)驗(yàn)分組均為高脂飲食組(HFD)和高脂飲食加EA組(HFD+EA),持續(xù)時(shí)間為14周。各組小鼠的血管進(jìn)行體外器官水平的血管舒張反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)選擇的是HVUECV的HOCl氧化損傷模型,對(duì)EA的抗氧化細(xì)胞保護(hù)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)一結(jié)果發(fā)現(xiàn),與單獨(dú)給予高脂飲食組相比,EA可以有效緩解動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程(P0.05)。在體外器官水平的實(shí)驗(yàn)二中,我們發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化模型的血管環(huán)中,EA可以顯著改善內(nèi)皮依賴(lài)的血管舒張功能以及緩解HOCl引起的內(nèi)皮功能障礙(P0.05)。另外,EA也可以顯著改善NO合成酶活性,以及血液抗氧化指標(biāo)和內(nèi)皮功能標(biāo)志物(P0.05)。Western blot分析結(jié)果顯示,EA可以顯著誘導(dǎo)血管組織中Nrf2和HO-1的表達(dá)(P0.05)。在實(shí)驗(yàn)二中,我們發(fā)現(xiàn)EA可以保護(hù)來(lái)自于WT小鼠的血管免受氧化損傷,但是這種效果在Nrf2-/-小鼠的血管氧化模型中并不存在(P0.05),提示Nrf2在EA的抗氧化保護(hù)作用中是關(guān)鍵蛋白。在實(shí)驗(yàn)三體外HVUECV細(xì)胞模型中,我們發(fā)現(xiàn)EA可以預(yù)防HOCl誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,同時(shí)明顯增強(qiáng)HO-1的表達(dá)(P0.05)。然而,EA所發(fā)揮的細(xì)胞保護(hù)作用均被Nrf2-si RNA顯著抑制(P0.05)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了EA的由Nrf2介導(dǎo)的抗動(dòng)脈粥樣硬化和內(nèi)皮功能改善作用。本課題基于國(guó)科金(No.81373947)分別在兩部分實(shí)驗(yàn)中探索血瘀證治療的潛在藥物、機(jī)制和靶點(diǎn)。以血瘀證為研究模型,以“化瘀解毒”中藥藥效物質(zhì)乳香酸和鞣花酸為工具藥物,旨在探索血瘀證病機(jī)以及對(duì)證中藥藥效物質(zhì)在宏觀層次上的“化瘀”作用以及微觀水平上的“解毒”作用,以期豐富“化瘀解毒”治療血瘀證的生物學(xué)內(nèi)涵。本課題中我們首次證實(shí)了乳香酸的腦保護(hù)作用以及鞣花酸的抗氧化的防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用,基于所得的研究結(jié)果,我們還將在未來(lái)的工作中對(duì)兩類(lèi)藥效物質(zhì)的協(xié)同作用及劑型的優(yōu)化進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R285
【圖文】：

圖 1. 全球腦卒中死亡率分布圖[22]中的病理機(jī)制及腦損傷過(guò)程非常復(fù)雜，是缺血損失和血液再灌注引起應(yīng)的綜合結(jié)果。這些機(jī)制在腦卒中發(fā)病的整個(gè)過(guò)程中相互關(guān)聯(lián)相互影響括：能量代謝障礙機(jī)制、興奮性氨基酸毒性機(jī)制、氧化應(yīng)激機(jī)制、炎癥機(jī)機(jī)制等。ROS 氧化損傷是腦卒中的關(guān)鍵病理機(jī)制，參與腦卒中以及后注損傷，同時(shí)腦組織也極易受到 ROS的攻擊損壞。因此，抗氧化治療中 I/R 損傷的研究熱點(diǎn)和方向之一[23]。

圖 2. 氧化應(yīng)激損傷參與腦卒中的過(guò)程[24]S 是導(dǎo)致腦卒中最重要的病理基礎(chǔ)，由于生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變、化程度的加重，AS患病人群日漸增多，使其成為當(dāng)前全世界醫(yī)學(xué)研究的熱AS 引起腦卒中是一個(gè)慢性進(jìn)行性病理過(guò)程，AS 發(fā)展形成斑塊，繼而形成腦有的研究認(rèn)為，AS是多種因素包括炎癥、感染等導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，以?xún)?nèi)皮功起點(diǎn)事件，繼而形成脂質(zhì)沉積、脂質(zhì)條紋和泡沫細(xì)胞，逐漸出現(xiàn) AS斑塊。引起血管狹窄。如果形成血栓則會(huì)引起血管的堵塞，或者出現(xiàn)斑塊脫落堵塞嚴(yán)重的后果，最終導(dǎo)致腦卒中或腦梗死的發(fā)作[17]�；瘧�(yīng)激存在于 AS從脂紋病變到斑塊破裂的整個(gè)發(fā)病進(jìn)程中，同時(shí)介導(dǎo)了血胞、平滑肌細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞損傷[25]。機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與，致使 ROS 在體內(nèi)大量蓄積并導(dǎo)致組織和細(xì)胞的損傷。氧化應(yīng)激為 AS 重因素之一。ROS 可以損傷內(nèi)皮依賴(lài)的血管擴(kuò)張、損傷內(nèi)皮細(xì)胞或能夠誘導(dǎo)

圖 3. AS 過(guò)程中的氧化應(yīng)激損傷[25]大量流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，長(zhǎng)期的水果、蔬菜的攝入有益于降低心亡率，這些積極的作用與其含有的抗氧化物質(zhì)密切相關(guān)[26]。體補(bǔ)充維生素、胡蘿卜素等抗氧化物質(zhì)對(duì) AS及腦卒中具有防治效藥效物質(zhì)，酚類(lèi)成分包括類(lèi)黃酮物質(zhì)、多酚類(lèi)化合物、酚酸等，物，對(duì)心腦血管疾病的防治也有顯著效果[28, 29]。1 通路與心腦血管疾病uclear factor erythroid-2-related factor 2）是調(diào)節(jié)氧化還原平衡的在轉(zhuǎn)錄水平控制多種抗氧化酶及ē相解毒酶的表達(dá)活性[30]。Nrf族的一員，含有六個(gè)的功能區(qū)（Nehl 到 Neh6）。在多種器官（

本文編號(hào)：2767252