【摘要】：人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是端粒酶的核心催化亞單位,在端粒酶活性發(fā)揮中起關(guān)鍵作用。正常體細(xì)胞中檢測(cè)不到端粒酶活性或其活性很低,而在生殖細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中端粒酶活性常呈增高。至少80%的人類腫瘤可以觀察到由端粒酶調(diào)控異常導(dǎo)致的酶活性異常增高。hTERT表達(dá)升高被認(rèn)為是細(xì)胞永生化和腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的標(biāo)志性指標(biāo)。腫瘤細(xì)胞能夠特異性地利用多種轉(zhuǎn)錄因子與hTERT啟動(dòng)子的結(jié)合促進(jìn)hTERT基因在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)。研究表明,端粒酶在結(jié)腸癌演變中具有重要的作用。因此,發(fā)現(xiàn)并鑒定結(jié)腸癌細(xì)胞中能夠特異性地與hTERT啟動(dòng)子結(jié)合的調(diào)控蛋白,研究其功能,對(duì)于了解結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制具有重要意義。目的在人結(jié)腸癌細(xì)胞中我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的腫瘤特異性hTERT啟動(dòng)子結(jié)合蛋白SUPT5H,通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究該蛋白的功能并闡明其與結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展的可能機(jī)制。方法以人結(jié)腸癌細(xì)胞株為模板,運(yùn)用鏈霉親和素-瓊脂糖珠垂釣法及染色質(zhì)免疫共沉淀垂釣、鑒定和驗(yàn)證SUPT5H為新的hTERT啟動(dòng)子結(jié)合蛋白；應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株和結(jié)腸癌細(xì)胞株核中SUPT5H蛋白的表達(dá)；利用RT-qPCR和免疫組化技術(shù)檢測(cè)人結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中SUPT5HmRNA和蛋白的表達(dá)；應(yīng)用hTERT啟動(dòng)子報(bào)告基因研究SUPT5H蛋白對(duì)hTERT啟動(dòng)子活性的影響；應(yīng)用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和shRNA干擾技術(shù)特異性地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株SUPT5H蛋白的表達(dá),研究SUPT5H蛋白對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、衰老和凋亡等生物學(xué)功能的影響。結(jié)果與人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株細(xì)胞核內(nèi)SUPT5H蛋白表達(dá)水平相比較,結(jié)腸癌細(xì)胞株核內(nèi)該蛋白呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)。人結(jié)直腸癌組織中,觀察到SUPT5H在mRNA和蛋白水平顯著的高表達(dá)。SUPT5H蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移正相關(guān)。利用SUPT5H基因特異性短發(fā)夾RNA抑制內(nèi)源性SUPT5H的表達(dá)能夠減弱hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白的表達(dá),但對(duì)CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白的表達(dá)未顯現(xiàn)出減弱的作用。干擾SUPT5H的表達(dá)不僅能夠有效地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞端粒酶的活性、細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移,還能促進(jìn)細(xì)胞衰老。結(jié)論SUPT5H是人結(jié)腸癌細(xì)胞中一個(gè)新的腫瘤特異性端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子結(jié)合蛋白。SUPT5H過表達(dá)激活了hTERT基因的轉(zhuǎn)錄。在人結(jié)直腸癌組織中,觀察到SUPT5H顯著的高表達(dá)。抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SUPT5H的表達(dá),展現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用。SUPT5H可能作為結(jié)直腸癌一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物和／或治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35
【圖文】：

為了驗(yàn)證在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中ＳＵＰＴ５Ｈ與ｈＴＥＲＴ啟動(dòng)子的腫瘤特異性結(jié)合能否在生逡逑理狀態(tài)下被重復(fù)，我們采用ＣＵＰ分析法，ＷＳＵＰＴ５Ｈ特異性抗體分析在活細(xì)胞中逡逑ＳＵＰＴ５Ｈ與染色體ｈＴＥＲＴ的結(jié)合情況（圖４．３）。Ｃｈｉｐ分析法證實(shí)ＳＵＰＴ５Ｈ與染色逡逑體ｈＴＥＲＴ的結(jié)合是腫瘤特異性的。逡逑廠廠Ｄ８４１逡逑ＣＯＮ邋ＳＷ６２０邋ＨＴ２９邋Ｃ0１0３２０邋ＲＫＯ邋ＨＣＥ８６９３逡逑．ＩＨＩＫｒ？，‘＊邐蹲早．‘－‘Ｍｌ逡逑圖４．３邋Ｃｈｉｐ分析法分析在活細(xì)胞中ＳＵＰＴ５Ｈ與染色體ｈＴＥＲＴ結(jié)合的情況。圖中在逡逑結(jié)腸癌細(xì)胞株巧Ｗ６２０，邋ＨＴ－巧，Ｃ0１0３２０，邋ＲＫＯ，邋ＨＣＥ８６９３）所對(duì)應(yīng)巧沫道中觀察到逡逑明顯的ＤＮＡ條帶，而在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株ＣＣＤ８４１邋ＣｏＮ中未顯現(xiàn)。ＮｏｒｍａｌＩｇＧ逡逑為陰性對(duì)照。逡逑２９逡逑

圖４．４邋（ａ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ方法檢測(cè)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株ＣＣＤ８４１ＣＯＮ核內(nèi)與結(jié)腸癌逡逑細(xì)胞株ＲＫＯ、ＨＴ２９核內(nèi)ＳＵＰＴ５Ｈ的表達(dá)情況�？梢娕c正常腸上皮細(xì)胞相比，結(jié)逡逑腸癌細(xì)胞株ＲＫＯ、ＨＴ２９核中ＳＵＰＴ５Ｈ的表達(dá)顯著提高。（ｂ）利用ＲＴ－ｑＰＣ艮技術(shù)逡逑檢測(cè)并分析比較了邋１５０例原發(fā)結(jié)直腸癌患者腫瘤}D織與其正常結(jié)直腸組織中逡逑ＳＵＰＴ}D和ｈＴＥＲＴ邋ｍＲＮＡ的表達(dá)，結(jié)果表明結(jié)直腸癌組織中ＳＵＦＴ沉和ｈＴＥ民Ｔ逡逑ｌｎＲＮＡ的表達(dá)水平顯著提高（＾＊＾ｐ＜化０５）。（Ｃ）邋１０例正常結(jié)直腸枯膜組織和１００例逡逑原發(fā)結(jié)直厥癌患者腫瘤組織中ＳＵＰＴ５Ｈ蛋白表這的免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)。肺瘤逡逑組織中ＳＵＰＴ５Ｈ蛋白的表達(dá)顯著高于正常結(jié)直腸枝膜組織（ｐ＜＾０５）。放大倍數(shù)逡逑ｘ２００邋和邋ｘ４００。逡逑４．５邋１５０例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中ＳＵＰＴ５Ｈ和ｈＴＥＲＴｍＲＮＡ表巧水逡逑平的相關(guān)挫分析逡逑

浙江大學(xué)博±學(xué)位論文邐正文一結(jié)巧逡逑４．７邋ＳＵＰＴ５Ｈ表達(dá)巧制結(jié)腸癌灥胞株的篩選逡逑使用ＲＮＡ干擾技術(shù)，采用ＳＵＰＴ５Ｈ基因特異化ｓｈＲＮＡ表達(dá)載體（ＴＧ３０９００５，逡逑ＯｒｉＧｅｎｅ）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞化ＲＫＯ和ＨＴ２９，利用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ技術(shù)檢測(cè)篩選逡逑ＳＵＰＴ５Ｈ表達(dá)抑制效果較好的細(xì)胞株，命名為ＲＫ０（ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－ｌ，化ＳＵＰＴ５Ｈ－２，逡逑ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－３）和邋ＨＴ２９（油ＳＵＰＴ５Ｈ－１，邋ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－２，ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－３）。并設(shè)立陰性對(duì)逡逑照（ＴＲ３０００７，邋ＯｒｉＧｅｎｅ），命名為邋ＲＫＯ（ｓｈＮＳＣ）和邋ＨＴ２９（ｓｈＮＳＣ）。逡逑

本文編號(hào)：2764518