發(fā)布時間：2017-03-27 18:15

  本文關(guān)鍵詞：HIF-1alpha對周期性張應(yīng)力誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的經(jīng)典正畸學(xué)牙齒移動的組織學(xué)變化是：外力作用在牙周組織產(chǎn)生壓力側(cè)和張力側(cè)；牙周膜壓力側(cè)牙周間隙變窄,血流量減少,膠原纖維和基質(zhì)降解吸收,破骨細(xì)胞分化,牙槽骨吸收；牙周膜張力側(cè)牙周間隙變寬,血流量增多,膠原纖維和基質(zhì)增生,成骨細(xì)胞分化,新生牙槽骨沉積。臨床上,正畸矯治力作用于牙齒引起牙周組織變化,造成牙槽骨改建,最終使牙齒發(fā)生移動。因此,骨改建是正畸牙齒移動的生物學(xué)基礎(chǔ),也是正畸治療的依據(jù)。在這個過程中,成骨細(xì)胞的活動在骨改建中處于“中心調(diào)控地位”,是正畸牙齒移動的生物學(xué)基礎(chǔ),但其在體內(nèi)無增殖分化能力,在發(fā)育完成后主要來源于機(jī)體內(nèi)的骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)儲備。BMSCs在正畸力的作用下可分化為成骨細(xì)胞,同時也可誘導(dǎo)生成破骨細(xì)胞,分別實現(xiàn)牙槽骨的沉積與吸收,進(jìn)行牙周骨組織的重建。因此,以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對象是進(jìn)一步探索正畸牙移動機(jī)制的有效途徑,深入研究應(yīng)力對其成骨分化的調(diào)控及其機(jī)制,可能會給正畸牙周骨組織修復(fù)重建提供新的思路。生長的微環(huán)境對其分化和表型的表達(dá)十分重要,以往的研究多集中在生物化學(xué)環(huán)境,對于生物力學(xué)環(huán)境的研究尚在起步階段。細(xì)胞在生物體內(nèi)受到各種生理應(yīng)力而發(fā)生相應(yīng)的生物學(xué)變化,然而,由于體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性,在生物體內(nèi)研究力學(xué)因素對細(xì)胞行為的影響就難以分辨是單一因素還是聯(lián)合作用。因此,系統(tǒng)研究生物力刺激對細(xì)胞的影響主要依賴于體外加力裝置,在目前研究較多的生物力形式中,張應(yīng)力是決定細(xì)胞功能和形變的主要因素。不同的張應(yīng)力可導(dǎo)致所有的細(xì)胞骨架發(fā)生整體構(gòu)架重排,繼而發(fā)生細(xì)胞形變,發(fā)出信息,并向細(xì)胞核內(nèi)傳遞信息,從而產(chǎn)生了不同效應(yīng)。因此,張應(yīng)力更能真實模擬體內(nèi)細(xì)胞受力的微環(huán)境,使體外培養(yǎng)的細(xì)胞的生長狀態(tài)更接近于體內(nèi)環(huán)境。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離于低氧環(huán)境下的骨髓(含氧1～7%),缺氧誘導(dǎo)因子-1 alpha (hypoxia-inducible factor 1 alpha, HIF-1 alpha)是低氧適應(yīng)病理反應(yīng)中的一個特異的調(diào)節(jié)因子和缺氧誘導(dǎo)條件下基因轉(zhuǎn)錄過程中信息傳遞的共同通路。在機(jī)體適應(yīng)缺氧環(huán)境的過程中,HIF-1 alpha起著關(guān)鍵的作用。正畸過程中施加的機(jī)械力在牙槽骨和牙根之間造成局部的缺氧環(huán)境,而局部微環(huán)境缺氧是啟動骨改建的重要因素之一。然而,力環(huán)境下HIF-1 alpha對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響是一個重要研究課題,其作用機(jī)理不明,國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。綜觀此領(lǐng)域的現(xiàn)有工作：目前關(guān)于周期性張應(yīng)力介導(dǎo)下HIF-1 alpha對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用的研究還很不充分,對周期性張應(yīng)力介導(dǎo)下HIF-1 alpha對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)理的闡述有利于指導(dǎo)臨床醫(yī)生采用不同的手段和方法調(diào)控或誘導(dǎo)骨改建,對臨床干預(yù)具有重要的指導(dǎo)意義,這正是實現(xiàn)正畸牙齒最優(yōu)化移動亟需解決的問題。本研究首先擬建立大鼠單側(cè)上頜正畸牙齒移動模型,體內(nèi)實驗檢測HIF-1alpha在受力區(qū)域的表達(dá)變化,研究牽張環(huán)境下牙槽骨中HIF-1 alpha的表達(dá)水平；同時進(jìn)行大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng),構(gòu)建骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型,施加相同頻率,不同力值大小和持續(xù)時間的動態(tài)張應(yīng)力刺激,根據(jù)張應(yīng)力力值和時間與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化之間的關(guān)系,篩選出促進(jìn)骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的最適張應(yīng)力；并在此基礎(chǔ)上,采用慢病毒包裝質(zhì)粒構(gòu)建沉默表達(dá)HIF-1 alpha的穩(wěn)定細(xì)胞系,對其施以最適成骨的張應(yīng)力刺激,研究HIF-1 alpha在周期性張應(yīng)力介導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化中的作用,并推測其可能的調(diào)控機(jī)制;明確力、HIF-1 alpha、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化三者之間的關(guān)系。本課題試圖闡明力學(xué)因素在調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的重要作用,從細(xì)胞力學(xué)角度揭示HEF-1 alpha在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的作用機(jī)制,為臨床正畸矯治提供理論依據(jù)。主要實驗方法及結(jié)果1.觀察牽張力環(huán)境下牙槽骨中HIF-1 alpha的表達(dá)變化：成功地建立大鼠上頜單側(cè)正畸牙移動模型,分別在未加力、加力1d、3d、7d、14d、28d時,處死大鼠,經(jīng)組織固定、脫鈣后,制作上頜右側(cè)第一磨牙牙周組織切片,行HE染色觀察其牙周組織形態(tài)學(xué)變化,免疫組織化學(xué)進(jìn)行半定量分析HIF-1 alpha和其下游基因VEGF的表達(dá)。本實驗發(fā)現(xiàn)在正常大鼠的牙周組織中基本上未見有明顯的HIF-1 alpha的陽性表達(dá),其下游靶基因VEGF表達(dá)也較弱;在正畸加力組中可見HIF-1 alpha的表達(dá)增強(qiáng),并且表達(dá)強(qiáng)度變化貫穿正畸牙周組織改建的全過程,靠近牙骨質(zhì)和牙槽骨表面的牙周膜區(qū)域強(qiáng)陽性表達(dá),中間部分的牙周膜也呈陽性表達(dá);VEGF表達(dá)雖不如HIF-1 alpha的強(qiáng),但也隨加力時間延長有增強(qiáng)趨勢。從而確定HIF-1 alpha參與了大鼠牙齒移動過程中牙周組織的改建,在正畸牙移動的機(jī)制中具有重要意義。2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定：將全貼壁法分離的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過體外分離培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增的方式獲得原代大鼠BMSCs。對細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)檢驗,MTT法檢測其增殖能力,LIVE/DEAD法檢測細(xì)胞的活力,有限稀釋法結(jié)晶紫染色證明其克隆形成能力；并將細(xì)胞分別用成骨誘導(dǎo)液及成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng),通過茜素紅染色、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)染色及油紅O染色證明其多向分化能力。從而對得到的大鼠BMSCs進(jìn)行細(xì)胞活性及干性的鑒定。3.確定最適體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的周期性張應(yīng)力條件：成功的構(gòu)建了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)-周期性張應(yīng)力加載力學(xué)刺激模型,并將細(xì)胞分為不加力組和加力組,其中加力組按1%、5%、15%的不同作用力值,以及0.5h、2h、6h、8h、12h的不同持續(xù)時間分為15組,分別施加周期性張應(yīng)力,作用力頻率均為1Hz。加力結(jié)束后對細(xì)胞進(jìn)行ALP堿性磷酸酶活性檢測,根據(jù)OD值篩選出最適宜大鼠BMSCs成骨分化的加力條件為1Hz頻率、5%拉伸強(qiáng)度,并加載6h。4.觀察周期性張應(yīng)力加載下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)HIF-1 alpha在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化：在體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs內(nèi)HIF-1 alpha表達(dá)很弱,但經(jīng)周期性張應(yīng)力刺激可促進(jìn)其在mRNA和蛋白水平的表達(dá),且隨加力時間延長表達(dá)增強(qiáng),mRNA水平表達(dá)變化與蛋白水平表達(dá)變化呈現(xiàn)較為一致的趨勢。表明HIF-1 alpha可對力學(xué)刺激做出陽性表達(dá)反應(yīng)。5.穩(wěn)定沉默表達(dá)HIF-1 alpha的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定：本實驗首先根據(jù)大鼠HIF-1 alpha基因序列設(shè)計了四個shRNA干擾靶點,并根據(jù)其基因序列設(shè)計并合成了四對含干擾序列的寡聚單鏈DNA,然后將其退火成雙鏈,插入shRNA漫病毒載體中,構(gòu)建四個shRNA慢病毒重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5 alpha,經(jīng)測序鑒定均為陽性克隆。之后進(jìn)行慢病毒包裝,病毒原液的收集和超濾濃縮,以及病毒滴度的測定。最后,用包裝好的四組shRNA慢病毒以及陰性對照的慢病毒分別感染大鼠BMSCs,通過Western Blotting評價干擾載體對靶基因的干擾效果,再向沉默表達(dá)HIF-lalpha的大鼠BMSCs再次轉(zhuǎn)染HIF-lalpha質(zhì)粒,造成目的基因的過表達(dá),通過Western blotting驗證靶基因的回復(fù)效應(yīng),表明本實驗的結(jié)果不是由于脫靶效應(yīng)產(chǎn)生的。選擇沉默效果最好的shRNA4感染后的靶細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定株,對穩(wěn)定株細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖活性及成骨分化能力鑒定均成功。6.觀察HIF-1 alpha在周期性張應(yīng)力大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的作用：對正常細(xì)胞、沉默表達(dá)HIF-1 alpha的細(xì)胞、陰性對照感染的細(xì)胞分別進(jìn)行最適力值的刺激,即加載1Hz頻率、5%拉伸強(qiáng)度的周期性張應(yīng)力6h,采用qPCR和Western blotting檢測三組細(xì)胞加力后的ALP活性,及成骨樣基因骨鈣素(Osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)、骨涎蛋白(Bone sialoprotein, BSP)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runt related transcription factor 2, RUNX2)、Osterix基因的mRNA和蛋白表達(dá)變化。正常大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)ALP,沉默表達(dá)HIF-1 alpha后,ALP表達(dá)活性升高(P0.05),但對照組細(xì)胞ALP表達(dá)未發(fā)生明顯變化(P0.05)。正常大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有OCN、OPN、BSP、RUNX2、 Osterix的mRNA和蛋白表達(dá),沉默表達(dá)HIF-1 alpha后,OCN、OPN、BSP、RUNX2、 Osterix的mRNA和蛋白表達(dá)均升高(P0.05),但對照組細(xì)胞OCN、OPN、BSP、 RUNX2、Osterix的mRNA和蛋白表達(dá)未發(fā)生明顯變化(P0.05)。同時檢測細(xì)胞HIF-1 alpha,及其下游基因VEGF和TWIST的mRNA和蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)正常大鼠骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞有VEGF、TWIST和HIF-1 alpha的mRNA和蛋白表達(dá),沉默表達(dá)HIF-1 alpha后VEGF和TWIST的表達(dá)量也有所減少(P0.05),但對照組細(xì)胞未發(fā)生明顯變化(P0.05)。推測成骨樣因子的變化可能與HIF-1 alpha下游基因VEGF和TWIST有關(guān),但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步驗證。結(jié)論1. HIF-1 alpha在大鼠單側(cè)上頜牙齒移動模型中的表達(dá)有明顯變化,從而確定其參與了大鼠牙齒移動過程中牙周組織的改建,在正畸牙齒移動的機(jī)制中具有重要意義。2.周期性張應(yīng)力刺激可誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨向分化,最適加力條件為1Hz頻率、5%拉伸強(qiáng)度,并加載6h。在該過程中HIF-1 alpha在mRNA及蛋白水平的表達(dá)均增強(qiáng),且隨加力時間延長表達(dá)增強(qiáng),表明HIF-1 alpha可對力學(xué)刺激作出陽性反應(yīng),從細(xì)胞水平證實HIF-1 alpha參與了力環(huán)境下成骨分化的過程。3.沉默表達(dá)HIF-1 alpha可促進(jìn)周期性張應(yīng)力加載下的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化。創(chuàng)新和意義本課題從細(xì)胞水平證實HIF-1 alpha參與了張力側(cè)牙齒移動過程中牙周組織的改建；提出了以HIF-1 alpha作為周期性張應(yīng)力介導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的生物學(xué)靶點：并采用了干擾目的基因片段的技術(shù)方法,從分子生物學(xué)水平證實,沉默HIF-1 alpha的表達(dá)可促進(jìn)周期性張應(yīng)力介導(dǎo)的成骨分化作用。
【關(guān)鍵詞】：低氧誘導(dǎo)因子1 alpha(Hypoxia-inducible factor-1alpha) 成骨分化 周期性張應(yīng)力 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchyumal stem cells BMSCs)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R783.5
【目錄】：

• 中文摘要8-13
• Abstract13-20
• 英文縮略語說明20-22
• 第一部分 大鼠正畸牙齒移動過程中HIF-1 alpha的表達(dá)和意義22-46
• 前言22-23
• 材料與方法23-31
• 結(jié)果31-33
• 討論33-36
• 小結(jié)36-37
• 附圖表37-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 第二部分 周期性張應(yīng)力介導(dǎo)的大鼠BMSCs成骨分化過程中HIF-1alpha的表達(dá)變化46-91
• 前言46-47
• 材料與方法47-67
• 結(jié)果67-71
• 討論71-78
• 小結(jié)78-79
• 附圖表79-87
• 參考文獻(xiàn)87-91
• 第三部分 周期性張應(yīng)力下HIF-1 alpha對大鼠BMSCs成骨分化的作用機(jī)制初探91-137
• 前言91-92
• 材料與方法92-114
• 結(jié)果114-120
• 討論120-124
• 小結(jié)124-125
• 附圖表125-133
• 參考文獻(xiàn)133-137
• 全文總結(jié)137-138
• 致謝138-140
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄140-141
• 英文論文一141-149
• 英文論文二149-159
• 學(xué)位論文評閱及答辯倩況表159

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳彬;李琥;穆超;侯偉;陳文靜;;大鼠正畸牙移動中HIF-1_α的表達(dá)[J];口腔生物醫(yī)學(xué);2011年02期

2 黃艷;王旭霞;張君;張文娟;;正畸牙移動實驗動物模型的建立[J];口腔醫(yī)學(xué);2007年02期

  本文關(guān)鍵詞：HIF-1alpha對周期性張應(yīng)力誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：270835