本文關(guān)鍵詞：Vasohibin1對(duì)結(jié)腸癌血管生成調(diào)控和腫瘤細(xì)胞抑制功能的臨床和分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的：結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,在美國(guó)每年大約有100,000新增病例、50,000死亡病例,在我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率約占所有惡性腫瘤的10%-15%。結(jié)腸癌的治療手段包括手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療等,結(jié)腸癌經(jīng)過(guò)根治性切除術(shù)和輔助化療,在5年內(nèi)仍有較高的復(fù)發(fā)率。研究表明,腫瘤的血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。腫瘤血管生成是一種動(dòng)態(tài)過(guò)程,是血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子相互作用的結(jié)果。Vasohibinl是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的血管抑制因子。Vasohibin (VASH)家族包括VAS H1和VASH2。VASH1由VEGF-A口FGF-2刺激產(chǎn)生,并選擇性的表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞。VASH1有兩個(gè)亞型、VASH1-A和VASH1-B。VASH1的同源異構(gòu)體VASH2主要表達(dá)于單核細(xì)胞。VASH1多表達(dá)在血管內(nèi)皮生成的終末區(qū),抑制新生血管形成。VASH2多表達(dá)在血管內(nèi)皮生成的起始端,促進(jìn)血管形成。VASH1作為血管生成抑制劑在腫瘤血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)VASH1在乳腺癌、尿路上皮癌、肝癌、肺癌等癌組織的血管內(nèi)皮中高表達(dá),并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),但在結(jié)腸癌中尚未有相關(guān)研究。此外VASH1不僅表達(dá)于血管內(nèi)皮,近年研究發(fā)現(xiàn)VASH1還表達(dá)于腫瘤細(xì)胞。但其具體的生物學(xué)功能,尤其在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展方面的功能,尚不清楚�；谝陨涎芯勘尘�,本課題主要通過(guò)分析VASH1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況,回顧性分析腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中VASH1的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞中VASH1的表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性；使用VASH1-A和VASH1-B的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29,使用shRNA干擾、沉默結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中VASH1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。通過(guò)以上途徑,研究VASH1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附、遷移等生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制,探討VASH1通過(guò)激活、參與細(xì)胞的凋亡、衰老,發(fā)揮其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用；使用皮下移植瘤模型和腫瘤轉(zhuǎn)移模型,進(jìn)一步驗(yàn)證VASH1對(duì)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制,為結(jié)腸癌靶向治療,開(kāi)辟新的方向和途徑。方法：1. VASH1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義：選取山東省濟(jì)南市中心醫(yī)院病理科存檔且臨床病理資料完整的75例結(jié)腸癌癌組織及相應(yīng)癌旁組織,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)在結(jié)腸癌組織中,VASH1在血管內(nèi)皮的表達(dá)、VEGF-A、 VEGF-C的表達(dá),以及腫瘤微血管密度(MVD, CD34標(biāo)記)、腫瘤微淋巴管密度(]LVD, D2-40標(biāo)記),分析血管內(nèi)皮表達(dá)VASH1與VEGF-A、CD34、VEGF-C.D2-40表達(dá)的相關(guān)性,及其與結(jié)腸癌相關(guān)臨床病理特征的相關(guān)性。2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)VASH1在結(jié)腸癌組織中腫瘤細(xì)胞的表達(dá),分析結(jié)腸癌組織中,腫瘤細(xì)胞表達(dá)VASH1與結(jié)腸癌相關(guān)臨床病理特征的相關(guān)性。3.使用Real Time PCR 和 Weastern Blot方法,檢測(cè)VASH1在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá),篩選VASH1的高表達(dá)細(xì)胞系和低表達(dá)細(xì)胞系。4.選用VASH1低表達(dá)細(xì)胞系HT29,轉(zhuǎn)染、過(guò)表達(dá)VASHl-A和VASH1-B,通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線、3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn),檢測(cè)VASH1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增值的影響；通過(guò)SA-β-gal染色和流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)VASH1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老和凋亡的影響。5. VASH1過(guò)表達(dá)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)小管形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)其對(duì)血管形成的影響。6. VASH1敲除對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：shRNA轉(zhuǎn)染VASH1高表達(dá)細(xì)胞系HCT116,敲除、沉默VASH1的表達(dá)。通過(guò)生長(zhǎng)曲線、3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn),研究VASH1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增值的影響。應(yīng)用粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VAS H1對(duì)腫瘤細(xì)胞粘附能力的影響。通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VASH1對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。7. VASH1過(guò)表達(dá)移植瘤模型建立：裸鼠皮下注射過(guò)表達(dá)VASH1-A, VASH1-B及空載體的結(jié)腸癌HT29細(xì)胞(5×106)。注射后每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小,繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。腫瘤超過(guò)2cm處死小鼠,取出腫瘤組織并稱重。移植瘤組織免疫組化檢測(cè)KI-67、Cleaved Caspase-3及CD34,研究VASH1在體內(nèi)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增值、凋亡及血管生成的影響；移植瘤組織SA-β-gal染色,檢測(cè)VASH1在體內(nèi)對(duì)組織衰老機(jī)制的影響。8. VASH1沉默移植瘤模型建立：Rag1-/-小鼠皮下注射轉(zhuǎn)染shRNA及Control shRNA的HCT116 (4×106)。其余方法同步驟6。9.轉(zhuǎn)移瘤模型建立：尾靜脈注射法將轉(zhuǎn)染shRNA及Control shRNA的HCT116(2×106)注射到Ragl-/-小鼠體內(nèi)。注射6周后處死小鼠,取肺、肝組織,解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移灶。使用OCT包埋組織速凍后,切片HE染色驗(yàn)證轉(zhuǎn)移灶。結(jié)果：1. VASH1蛋白在結(jié)腸癌組織間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),而不表達(dá)于間質(zhì)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。過(guò)表達(dá)VASH1-A或VASH1-B的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,可形成不完整的管狀結(jié)構(gòu),且其分支點(diǎn)數(shù)低于空白載體組,差異有顯著性(p≤0.01)。VASH1在結(jié)腸癌組織間質(zhì)的表達(dá)明顯高于癌旁組織(p0.01),兩者呈正相關(guān)(p=0.004)。VEGF-A、CD34、VEGF-C、D2-40在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá),均高于癌旁組織(p0.01)。結(jié)腸癌腫瘤間質(zhì)VASH1的表達(dá)與MVD表達(dá)呈正相關(guān),與VEGF-A、VEGF-C、LVD無(wú)相關(guān)性。結(jié)腸癌腫瘤間質(zhì)VASH1的表達(dá)與腫瘤體積(p=0.021124)、腫瘤臨床分期(p=0.0069078)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(p=0.0031225)呈負(fù)相關(guān)。2. VASH1在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義：免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示在結(jié)腸癌組織切片中,VASHl也腫瘤細(xì)胞中表達(dá),并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(p=0.01613).3. VASH1在腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)：Real Time PCR檢測(cè)VASH1-A, VASH1-B在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。VASH1-A在所檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞系中均有表達(dá),其中乳腺癌MCF7表達(dá)最高。結(jié)腸癌細(xì)胞系中HT29表達(dá)最低,HCT116表達(dá)最高。VASH1-B在所檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞系中均有表達(dá),其中乳腺癌MCF7表達(dá)最高。結(jié)腸癌細(xì)胞系中HT29表達(dá)最低,HCT116表達(dá)最高。4.過(guò)表達(dá)VASH1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：通過(guò)生長(zhǎng)曲線、3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn),檢測(cè)過(guò)表達(dá)VASH1-A, B基因后對(duì)HT29細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響。與對(duì)照組相比,VASH1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及克隆形成能力明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),提示過(guò)表達(dá)ASH1-A、B基因抑制HT29細(xì)胞增殖,使其生長(zhǎng)速度減緩,克隆形成能力降低；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示過(guò)表達(dá)VASH1-B促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡(p0.01)。SA-β-gal染色結(jié)果提示過(guò)表達(dá)VASH1-A促進(jìn)腫瘤細(xì)胞衰老(p0.01)5.敲除VASH1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：通過(guò)生長(zhǎng)曲線、3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn),檢測(cè)沉默VASH1基因后HCT116細(xì)胞的增殖情況。與對(duì)照組相比,shRNA干擾組細(xì)胞的增殖速度顯著提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果,shRNA干擾、沉默VASH1顯著提高HCT116細(xì)胞的粘附能力。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,shRNA干擾、沉默VASH1顯著增強(qiáng)HCT116細(xì)胞的遷移能力(p0.05)。6.通過(guò)HT29細(xì)胞裸鼠皮下移植模型,觀察VASH1在體內(nèi)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增值的影響：腫瘤體積曲線顯示,VASH1-A、VASH1-B過(guò)表達(dá)組腫瘤生長(zhǎng)速度顯著低于空載體對(duì)照組(p=0.025)。檢測(cè)腫瘤重量提示,空載體對(duì)照組腫瘤重量明顯高于VASH1-A、VASH1-B過(guò)表達(dá)組(p0.01)。免疫組合檢測(cè)顯示,VASH1-A、 VASH1-B過(guò)表達(dá)組,腫瘤組織KI-67的表達(dá)小于空載體對(duì)照組(p0.05)；VASH1-B過(guò)表達(dá)組,腫瘤組織Cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著高于空載體對(duì)照組(p0.01)；腫瘤組織表達(dá)的CD34在三組間無(wú)明顯差異。SA-β-gal染色結(jié)果顯示,VASH1-A過(guò)表達(dá)組,陽(yáng)性細(xì)胞高于空載體對(duì)照組(p0.05)。7.通過(guò)HCT116細(xì)胞Rag1-/-小鼠皮下移植模型,觀察VASH1在體內(nèi)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增值的影響：腫瘤體積曲線顯示,shRNA沉默組腫瘤生長(zhǎng)速度顯著快于control shRNA組(p0.01)。腫瘤重量結(jié)果顯示,shRNA沉默組腫瘤重量大于. control shRNA組(p0.05)。免疫組化結(jié)果提示,shRNA沉默組KI-67表達(dá)高于control shRNA組。8.通過(guò)HCT116細(xì)胞Rag1-/--/-鼠轉(zhuǎn)移瘤模型,觀察VASH1對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的影響：成模后6周取肺、肝組織,計(jì)數(shù)表面腫瘤表面轉(zhuǎn)移灶。切片HE染色進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果提示,shRNA沉默組肺組織的腫瘤轉(zhuǎn)移灶(p0.05)及肝組織的腫瘤轉(zhuǎn)移灶(p0.01)明顯高于control shRNA組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：1. VASH1表達(dá)于結(jié)腸癌間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,抑制血管生成并與腫瘤體積、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。2. VASH1表達(dá)于結(jié)腸癌組織的腫瘤細(xì)胞,與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。提示腫瘤細(xì)胞表達(dá)的VASH1,與血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的VAS HI功能不同。3.誘導(dǎo)VASH1在結(jié)腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)、沉默,證實(shí)VASH1可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增值、粘附及遷移。4. VASH1-A參與誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老；VASH1-B可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。VASH1-A和VASH1-B通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用。5.皮下移植瘤模型證實(shí),VASH1在體內(nèi)環(huán)境下,通過(guò)激活、刺激結(jié)腸癌細(xì)胞衰老、凋亡機(jī)制,抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖。6.轉(zhuǎn)移瘤模型證實(shí),VAS H1沉默后,顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的體內(nèi)遷移、轉(zhuǎn)移,阻斷了VASH1對(duì)腫瘤的抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌 Vasohibin-1 細(xì)胞衰老 細(xì)胞凋亡 血管生成
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• ABSTRACT11-17
• 符號(hào)說(shuō)明17-19
• 第一部分 結(jié)腸癌間質(zhì)Vasohibin-1的表達(dá)及臨床意義19-52
• 前言19-21
• 材料與方法21-28
• 結(jié)果28-32
• 討論32-37
• 結(jié)論37-38
• 附圖表38-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 第二部分 Vasohibin-1在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞抑制功能的機(jī)制研究52-120
• 前言52-53
• 材料與方法53-78
• 結(jié)果78-85
• 討論85-92
• 結(jié)論92-93
• 附圖表93-115
• 參考文獻(xiàn)115-120
• 致謝120-121
• 發(fā)表論文及獲獎(jiǎng)情況121-122
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表122-123
• 英文文章Ⅰ123-139
• 英文文章Ⅱ139-166

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王毅;王芳;趙宏宇;王陽(yáng);周余來(lái);原田守;山田亮;伊東恭悟;;前列腺酸性磷酸酶——結(jié)腸癌主動(dòng)免疫治療新靶點(diǎn)[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2008年18期

2 邵世和,謝立蘋,霍龍;硒與結(jié)腸癌研究進(jìn)展[J];北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2003年05期

3 程文芳,顧曉紅,錢偉,易粹瓊;結(jié)腸癌中腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體的表達(dá)[J];胃腸病學(xué);2003年02期

4 郭艷麗,閆慧明,宋善俊;組織因子在結(jié)腸癌表達(dá)的臨床意義(英文)[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2005年15期

5 李建國(guó);王雙燕;沈若武;王守彪;;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與結(jié)腸癌的相關(guān)性研究[J];山東醫(yī)藥;2006年07期

6 孫軍;沈磊;羅和生;沈志祥;;結(jié)腸癌瘦素和瘦素受體表達(dá)及其意義[J];中華消化雜志;2006年08期

7 宋e

本文編號(hào)：270928