本文關(guān)鍵詞：牙胚三維數(shù)字化模型的構(gòu)建及含細胞3D打印生物墨水的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：組織或器官再生的目標是完全恢復缺失組織或器官的結(jié)構(gòu)和功能。牙科學研究者們熱切歡迎三維細胞打印構(gòu)建組織工程牙齒的技術(shù),因為它可能代表一種理想的組織器官替代醫(yī)學的方法。人的牙齒替換只有一次,牙釉質(zhì)本身不能再生。因此,當牙齒或釉質(zhì)缺失,需人工重建。研究成牙組織工程和干細胞生物學的目的是明確更換丟失或損壞的牙齒的策略方法。由干細胞衍生的特定組織,如牙本質(zhì)和骨,已臨床應用,但完整牙齒的組織工程方法仍在研究中。三維數(shù)字化組織工程再造復合型、多胚層來源的功能性組織和器官的一個基本要求,就是首先要充分明確該組織器官的組成成分以及他們之間的組織結(jié)構(gòu)。醫(yī)學影像技術(shù)是組織工程必不可少的工具,可以在細胞、組織、器官直至生物體水平提供三維結(jié)構(gòu)以及功能學信息。這些技術(shù)包括計算機斷層掃描和磁共振成像,計算機輔助設(shè)計和計算機輔助制造工具和數(shù)學建模也用來收集組織的復雜斷層結(jié)構(gòu)信息并加以數(shù)字化。完成的組織或器官模型將導入數(shù)字化模擬控制的生物打印設(shè)計和制造系統(tǒng)。系統(tǒng)軟件完成將三維重建模型逆向切片到二維的實現(xiàn)過程,使得3D模型分為薄層二維水平切片,然后導入到生物打印系統(tǒng)。包含在二維水平切片的解剖和結(jié)構(gòu)信息提供生物打印機分層打印不同細胞及胞外基質(zhì)的指令數(shù)據(jù)。我們基于構(gòu)建三維細胞噴墨生物打印機的系統(tǒng)要求,在本研究采用了多種方法構(gòu)建三維數(shù)字化牙胚作為三維細胞噴墨打印的模板。牙胚發(fā)育過程參與細胞明確,結(jié)構(gòu)相對簡單,本研究選擇牙胚作為三維生物打印技術(shù)研究的模式器官具有創(chuàng)新性與先進性。第一部分犬發(fā)育早期牙胚三維數(shù)字化模型的構(gòu)建與分析,包括三個實驗。實驗一,不同發(fā)育時期犬恒牙胚的Micro CT三維數(shù)字化模型的構(gòu)建。選擇新生犬,4周齡與5月齡犬作為不同發(fā)育階段的代表,使用Micro CT和CBCT研究牙胚發(fā)育狀態(tài)。結(jié)果表明新生犬乳牙牙冠礦化,恒牙胚尚未見明顯發(fā)育。5月齡犬處于乳恒牙替換開始期,恒牙胚牙冠已礦化,大部分牙齒處于替換期。4周齡犬處于乳牙開始萌出期,第四恒前磨牙及第一恒磨牙牙胚體積大,分別為967.4 mm3與46.6 mm3,處于未礦化鐘狀期,適于作為后續(xù)細胞打印構(gòu)建發(fā)育期牙胚的三維數(shù)字化模板。本研究首次以20μm的超精細分辨率構(gòu)建了4周齡犬發(fā)育期牙胚的Micro CT三維數(shù)字化模型,該模型的分辨率達到了細胞水平,單個像素基本可以對應1個細胞,基本可以滿足單細胞噴墨打印的需求。另外該三維牙胚模板可以進行多種三維數(shù)字化文件格式的轉(zhuǎn)化與識別,可以任意角度與層厚進行再切片運算,可以生成不同層厚與分辨率的二維打印模板數(shù)據(jù),從而滿足部分三維生物打印系統(tǒng)的需要。構(gòu)建的三維數(shù)字化模板以Micro CT數(shù)據(jù)構(gòu)建,無法實現(xiàn)牙胚多種細胞的精細空間定位與細胞密度分配,另外對于細胞外基質(zhì)與細胞的比例也無法進行分析,對于毛細血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)也無法分辨構(gòu)建,這就要求進一步使用組織學方法來構(gòu)建超精度的牙胚三維數(shù)字化模板以滿足多細胞打印的準確定位與細胞密度及胞外基質(zhì)比例控制。實驗二,犬鐘狀期恒牙胚細胞學三維數(shù)字化模型的構(gòu)建。我們選擇實驗一的4周齡幼犬的第四恒前磨牙牙胚作為三維組織學重建的研究對象,采用HE染色連續(xù)牙胚切片,共切取切片730張,其中獲得684張有效切片,有效切片率93.7%。使用Pannoramic SCAN數(shù)字化切片掃描系統(tǒng)依次進行掃描,獲得分辨率為0.52μm/像素的掃描數(shù)據(jù),以實驗一完成的Micro CT三維重建數(shù)據(jù)進行組織切片的對正校準,對正后的切片數(shù)據(jù)導入Pannoramic Viewer軟件,對牙胚切片數(shù)據(jù)進行三維重建,構(gòu)建了發(fā)育早期牙胚的微米級三維立體細胞學數(shù)字化模型,軟件可以將上述模型轉(zhuǎn)化為多種格式,適于不同需要。實驗三,犬恒牙胚中多種細胞、胞外基質(zhì)及微血管的空間分布與定位研究。使用Pannoramic Viewer和Pannoramic Histo Quant軟件進行計算機圖形分析,對牙胚細胞學三維數(shù)字化模型進行多種細胞、胞外基質(zhì)及微血管的空間分布與定位研究,為合理構(gòu)建細胞墨水的成分,構(gòu)建三維打印軟件可識別的打印模板提供解決方案。結(jié)果表明牙乳頭區(qū)域細胞空間分布密度為約44.74×106/ml,牙囊區(qū)域細胞密度為16.20×106/ml,星網(wǎng)狀層細胞密度為8.30×106/ml。外釉上皮層細胞5-8層,寬度50-60μm,細胞密度3-4×108/ml。內(nèi)釉上皮層細胞4-6層,寬度40-50μm,細胞密度8-10×108/ml。成牙本質(zhì)細胞層細胞3-5層,寬度30-40μm,細胞密度8-10×108/ml。上皮根鞘細胞密度達3-5×108/ml。每毫升牙囊結(jié)構(gòu)中的細胞體積比例為0.021ml,牙乳頭結(jié)構(gòu)中的細胞體積比例為0.137ml,星網(wǎng)狀層結(jié)構(gòu)中的細胞體積比例為0.007ml,其余為胞外基質(zhì)的體積。牙胚的牙囊與牙乳頭結(jié)構(gòu)中存在血管網(wǎng)絡(luò),而在成釉器星網(wǎng)狀層結(jié)構(gòu)中未見血管網(wǎng)存在,牙乳頭中的血管結(jié)構(gòu)分布密度為26.3±4.6個/mm2,牙囊中的血管結(jié)構(gòu)分布不均勻,微血管及毛細血管交叉存在。使用Imaris軟件可以三維重建局部血管網(wǎng),立體直觀顯示血管結(jié)構(gòu),可以提供后續(xù)血管網(wǎng)打印的模板。該模型中獲得的各型細胞的分布特點與密度為進一步構(gòu)建含細胞生物墨水提供理論依據(jù)。第二部分,含細胞海藻酸鈉水凝膠3D打印生物墨水的研制與性能測試,包括三個實驗。利用體外培養(yǎng)牙胚發(fā)育相關(guān)細胞,構(gòu)建了基于海藻酸鈉水凝膠的生物墨水,利用墨滴觀測儀等設(shè)備研究了生物墨水穩(wěn)定打印的理化條件,獲得了穩(wěn)定打印的細胞生物墨水配方。體外誘導牙乳頭細胞分化,研究了打印對于細胞分化,活力,增殖等生物學性能的影響,明確本研究構(gòu)建的生物墨水對于穩(wěn)定打印細胞并維持細胞生物學特性無顯著影響,為進一步三維多種細胞打印構(gòu)建組織工程牙胚提供了必要的技術(shù)支持。實驗一,牙乳頭細胞的分離培養(yǎng)與鑒定�；诘谝徊糠肢@得的犬早期發(fā)育牙胚,在體外培養(yǎng)牙乳頭細胞并對其生物學性狀進行了研究。通過流式細胞儀檢測細胞表面抗原的分析,造血干細胞標記表達陰性,間充質(zhì)細胞標志物表達陽性。體外培養(yǎng)牙乳頭細胞成骨誘導后ALP活性高于對照組細胞,骨鈣素含量約為對照組細胞20倍。成骨誘導組細胞出現(xiàn)明顯的礦化鈣結(jié)節(jié),鈣黃綠素定量熒光分析結(jié)果顯示成骨誘導組的熒光強度明顯高于對照組。研究表明牙乳頭細胞為具有成骨分化的間充質(zhì)細胞。實驗二,3D打印生物墨水的研發(fā)及其打印穩(wěn)定性研究�；诤Ｔ逅徕c制備生物墨水,使用ARG2流變儀與FM40 Easy Drop接觸角測量儀,測量液體粘度與表面張力。以1.0%海藻酸鈉DMEM培養(yǎng)液制備生物墨水,添加0.05%枸櫞酸鈉拮抗DMEM培養(yǎng)液中的鈣離子,0.1%泊洛沙姆188與含氟表面活性劑0.01%Capstone#174;FS-3100或0.05%Novec#174;FC-4430聯(lián)合降低表面張力,制備了滿足壓電式噴頭打印所需粘度與表面張力特性的生物墨水,墨水粘度特性滿足細胞穩(wěn)定懸浮需要。使用XAAR128壓電陣列式打印噴頭與墨滴觀測儀進行含細胞生物墨水打印測試,通過優(yōu)化生物墨水中的細胞濃度為1.2×107細胞/ml,可以實現(xiàn)平均每個打印墨滴中含有單個細胞的穩(wěn)定打印。實驗三,噴射打印對細胞活力、增殖、分化與細胞特性的影響。將牙乳頭細胞以6×106細胞/ml的濃度懸浮于含表面活性劑的生物墨水中,將5×104個細胞噴墨打印至12孔板,加入1ml DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),作為細胞打印組;將同等濃度細胞懸浮于無表面活性劑的生物墨水中,取5×104個細胞加入1ml培養(yǎng)液中作為無表面活性劑組;將5×104個牙乳頭細胞直接加入1ml培養(yǎng)液中作為對照組。結(jié)果表明牙乳頭細胞懸浮于無表面活性劑生物墨水的生存活力稍高于單獨暴露于DMEM培養(yǎng)液的對照組細胞,噴墨打印的牙乳頭細胞相對于對照組,仍然保持95%的細胞存活,并且證明在48小時后的增殖速度與對照組無明顯差異。打印后牙乳頭細胞成骨誘導分化的骨鈣素表達與對照組無明顯差別,結(jié)果表明,噴墨打印對牙乳頭細胞成骨分化能力無明顯影響。本研究進一步證明,研究構(gòu)建的藻酸鹽生物墨水具有穩(wěn)定的打印特性,可以從XAAR128陣列式打印噴頭穩(wěn)定噴射,同時保持打印的細胞密度和細胞活力及增殖分化能力。本研究使標準的商業(yè)化打印噴頭完美打印細胞構(gòu)建組織工程器官成為可能,允許多種細胞高通量快速構(gòu)建組織。以后的進一步研究中,我們需要進行的重點工作是研發(fā)可同時噴墨打印多種細胞與材料的三維生物打印機,這是制造多層細胞結(jié)構(gòu)和更大組織器官的基本需求。我們將使用多組XAAR128陣列式打印噴頭,構(gòu)建可以同時打印多種材料與細胞的三維生物打印機,利用本研究構(gòu)建的三維牙胚數(shù)字化模型作為打印模板,分層打印多種牙胚細胞與胞外基質(zhì)以構(gòu)建可發(fā)育牙胚,并深入研究促進牙胚的體外發(fā)育礦化。
【關(guān)鍵詞】：組織工程 牙胚 三維生物打印 數(shù)字化模板 生物墨水 牙乳頭細胞 海藻酸鈉
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R783.5
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-18
• 文獻回顧18-38
• 第一部分 犬發(fā)育早期牙胚三維數(shù)字化模型的構(gòu)建與分析38-60
• 實驗一 不同發(fā)育時期犬恒牙胚的Micro CT三維數(shù)字化模型的構(gòu)建與分析39-45
• 1 研究對象39
• 2 實驗方法39-40
• 3 結(jié)果40-41
• 4 討論41-45
• 實驗二 犬鐘狀期恒牙胚細胞學三維數(shù)字化模型的構(gòu)建45-52
• 1 材料和方法45-49
• 2 結(jié)果49
• 3 討論49-52
• 實驗三 犬恒牙胚中多種細胞、胞外基質(zhì)及微血管的空間分布與定位研究52-60
• 1 材料與方法52-53
• 2 結(jié)果53-55
• 3 討論55-60
• 第二部分 含細胞海藻酸鈉水凝膠 3D打印生物墨水的研制與性能測試60-87
• 實驗一 牙乳頭細胞的分離培養(yǎng)與鑒定62-70
• 1 材料和方法62-66
• 2 結(jié)果66
• 3 討論66-70
• 實驗二 3D打印生物墨水的研發(fā)及其打印穩(wěn)定性研究70-81
• 1 材料70-72
• 2 方法72-74
• 3 結(jié)果74-78
• 4 討論78-81
• 實驗三 噴射打印對細胞活力、增殖、分化與細胞特性的影響81-87
• 1 材料81
• 2 方法81-82
• 3 結(jié)果82-85
• 4 討論85-87
• 小結(jié)87-88
• 參考文獻88-109
• 個人簡歷和研究成果109-111
• 致謝111-112
• 臨床病例報告112-136

【共引文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：牙胚三維數(shù)字化模型的構(gòu)建及含細胞3D打印生物墨水的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：270642