本文關(guān)鍵詞：NFKB家族基因標(biāo)簽SNP的篩選及其與創(chuàng)傷并發(fā)癥的關(guān)聯(lián)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景世界范圍內(nèi),創(chuàng)傷已經(jīng)占世界總死亡原因的10%和總致殘原因的16%。近年來,因為院前急救技術(shù)不斷取得進(jìn)展,如抗生素的早期規(guī)范運用,經(jīng)歷嚴(yán)重創(chuàng)傷的患者普遍能存活下來,但患者入院后往往伴隨著并發(fā)癥,如膿毒癥(sepsis)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的發(fā)生[1]�，F(xiàn)在已經(jīng)證明,嚴(yán)重創(chuàng)傷患者失調(diào)的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致了膿毒癥和多器官功能障礙綜合征的發(fā)生,而越早發(fā)現(xiàn)和治療膿毒癥和多器官障礙綜合征對患者的預(yù)后越好[2]。隨著研究更加深入,單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和機體抗感染免疫反應(yīng)之間的聯(lián)系日益清晰[3,4]。這些關(guān)聯(lián)研究的結(jié)論不僅能夠為治療感染類疾病提供藥物靶點,也使我們對疾病發(fā)生發(fā)展的生物機制了解更加透徹。Nuclear factor-κB(NFKB)基因家族在創(chuàng)傷病人膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。人類NFKB家族包括五個成員:p50,p52,p65(RelA),RelB,和c-Rel,分別由NFKB1、NFKB2、RELA、RELB和REL基因編碼。NFKB同源或異源二聚體調(diào)控一系列基因表達(dá),細(xì)胞增殖、分化、凋亡[5,6]。在靜息細(xì)胞,絕大多數(shù)NFKB二聚體結(jié)合抑制蛋白以非激活形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。許多細(xì)胞外刺激因子,包括細(xì)菌脂多糖(bacterial lipopolysaccharide,LPS)、病毒、氧化劑、炎性細(xì)胞因子和免疫刺激因子能激活NFKB[7,8]。一旦NFKB激活,NFKB二聚體從細(xì)胞漿釋放,轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并協(xié)調(diào)靶基因如前炎癥因子、趨化因子、炎癥相關(guān)酶和粘附分子的轉(zhuǎn)錄[9,10]。NFKB還調(diào)控參與固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)的基因[11,12]。NFKB家族在sepsis發(fā)生發(fā)展中的重要作用使得它成為一個關(guān)聯(lián)分析中很有前景的候選基因。盡管一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了NFKB基因家族上的一些單核甘酸多態(tài)性位點,但這些位點是否與嚴(yán)重創(chuàng)傷后患者的免疫炎癥反應(yīng)以及膿毒癥和多器官功能障礙綜合征的發(fā)生發(fā)展有關(guān)還不清楚。本研究的目的是尋找NFKB家族基因上的能代表全基因遺傳變異信息的標(biāo)簽SNP位點,探索NFKB家族基因多態(tài)性與創(chuàng)傷膿毒癥易患性的聯(lián)系。我們首先挑選出NFKB家族基因的標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點;其次,將來自和膿毒癥關(guān)聯(lián)最密切的nfkb經(jīng)典通路中的四個標(biāo)簽snp位點在重慶地區(qū)創(chuàng)傷人群中進(jìn)行臨床驗證,尋找與膿毒癥發(fā)病和mods評分相關(guān)的多態(tài)性位點;最后,我們探索了發(fā)現(xiàn)的與膿毒癥發(fā)病相關(guān)的標(biāo)簽snp位點的可能存在的功能,觀察該多態(tài)性位點對細(xì)胞因子表達(dá)的影響。材料與方法1.挑選nfkb家族標(biāo)簽snp位點。從genbank數(shù)據(jù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中獲得nfkb基因家族(nfkb1,nfkb2,rela,relb和rel)全基因和上下游5kb內(nèi)的基因序列信息;從hapmap數(shù)據(jù)庫(www.hapmap.org)獲得nfkb基因家族全基因及其延伸范圍在中國北京漢族人群(chinesehanbeijing,chb)中的snp基因型數(shù)據(jù)。使用軟件haploviewversion4.2(broadinstituteofmitandharvard,cambridge,mass)對每個nfkb基因家族成員構(gòu)建單倍型block,并利用獲得各個snp之間的連鎖不平衡(linkagedisequilibrium,ld)關(guān)系結(jié)合關(guān)聯(lián)研究挑選標(biāo)簽snp位點。2.對來自nfkb經(jīng)典激活通路(包括nfkb1,rela和rel基因)上的標(biāo)簽或潛在功能性snp位點在重慶嚴(yán)重創(chuàng)傷人群中用焦磷酸測序法進(jìn)行基因分型,探索這些多態(tài)性位點與膿毒癥和多器官功能障礙綜合征的聯(lián)系。研究人群:我們總共獲得連續(xù)收集的753例無關(guān)聯(lián)重慶地區(qū)漢族嚴(yán)重創(chuàng)傷患者樣本,來自重慶大坪醫(yī)院和重慶急救中心,時間自2005年1月至2014年6月。snp位點基因分型:獲得血液樣本后,使用試劑盒提取dna,存于-80?c冰箱。使用焦磷酸測序法進(jìn)行基因分型[20]。根據(jù)雙盲原則,分型由不知道患者臨床特征的人員完成。為了保證分型的準(zhǔn)確性,10%的樣本進(jìn)行了重復(fù)驗證。數(shù)據(jù)處理:本研究使用了最適宜處理多基因疾病的log-additiveinheritancemodel模型。我們通過計數(shù)的方法計算出各等位基因頻率。為計算各snp位點基因型在人群中的分布是否滿足哈-溫平衡(hardy-weinbergequilibrium,hwe),我們選擇卡方檢驗法,p值大于0.05表示基因型分布滿足hwe,即在我們研究的創(chuàng)傷人群中各snp位點基因型在遺傳過程中保持相對穩(wěn)定,研究結(jié)論在這一群體中有廣泛代表意義。我們利用協(xié)方差分析計算snp基因型與mods評分之間的關(guān)聯(lián)性。利用軟件haploview獲得同一基因上各snp之間的連鎖不平衡值。我們在顯性、隱形和等位基因遺傳模式下利用卡方檢驗計算各標(biāo)簽snp位點基因型與膿毒癥發(fā)病關(guān)聯(lián)。所有的p值為雙邊檢驗,并利用bonferroni校正。p值小于0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。3.體外腫瘤壞死因子-α檢測為探索膿毒癥和多器官功能障礙綜合征易患多態(tài)性位點與細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性,我們依據(jù)majetschak等人方法檢測血漿中的細(xì)胞因子表達(dá)水平。簡要步驟是把從創(chuàng)傷患者采集到的全血分為兩等分,一管加入lps(100ng/ml),另一管為對照。兩者均在在37℃下孵育4小時。之后用elisa試劑盒檢測離心后血漿中的腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha,tnf-a)的表達(dá)水平并分析其與多態(tài)性位點基因型之間的關(guān)系。結(jié)果1.單倍型的構(gòu)建和標(biāo)簽snp選擇獲得的中國北京漢族人群中的snp基因型數(shù)據(jù)后,通過構(gòu)建單倍型block圖譜從nfkb家族基因中挑選出8個具有代表性和潛在功能性的標(biāo)簽snp(rs28362491,rs3774932,rs4648068,rs7119750,rs4803789,rs12609547,rs1560725andrs842647)。挑選的所有位點在中國北京漢族人群中最小等位基因頻率(maf)均大于0.05。2.標(biāo)簽snp在創(chuàng)傷人群中的等位基因頻率和基因型分布四個標(biāo)簽snp的分型成功率在98.3%到100%之間。分型結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中中國北京漢族人群的最小等位基因頻率接近�；蛐头植紳M足hardy-weinbergequilibrium(p0.05)。3.標(biāo)簽snp與sepsis和mods的臨床關(guān)聯(lián)在4個進(jìn)行關(guān)聯(lián)驗證的snp(rs28362491,rs4648068,rs7119750andrs842647)中,我們發(fā)現(xiàn)來自rel基因的多態(tài)性位點rs842647g/a與膿毒癥患病風(fēng)險相關(guān),并且和mods評分相關(guān),其中aa基因型患者較g等位基因攜帶者有較低的膿毒癥發(fā)生率,mods評分更低。4.多態(tài)性位點rs842647與lps誘導(dǎo)的tnf-α表達(dá)水平聯(lián)系研究發(fā)現(xiàn)rs842647位點g等位基因與lps誘導(dǎo)的血漿tnf-α高水平表達(dá)相關(guān)。結(jié)論本研究首次對通過使用標(biāo)簽SNP方法對NFKB1,RELA和REL全基因范圍內(nèi)SNP位點進(jìn)行臨床關(guān)聯(lián)分析。我們發(fā)現(xiàn),多態(tài)性位點rs842647G/A與膿毒癥患病風(fēng)險和MODS的嚴(yán)重程度相關(guān)并且影響LPS誘導(dǎo)的血漿TNF-α表達(dá)水平。這表明多態(tài)性位點rs842647可能用于評估膿毒癥和MODS的易患風(fēng)險。
【關(guān)鍵詞】：NFKB SNP 創(chuàng)傷 膿毒癥 MODS
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R641
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-19
• 第二章 NFKB家族基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點的篩選19-38
• 2.1 材料與方法19-21
• 2.2 基因序列數(shù)據(jù)21-24
• 2.3 NFKB家族基因SNP數(shù)據(jù)24
• 2.4 結(jié)果24-37
• 2.5 討論37-38
• 第三章 創(chuàng)傷膿毒癥高�；蚨鄳B(tài)性的臨床多關(guān)聯(lián)研究38-57
• 3.1 材料與方法38-48
• 3.2 統(tǒng)計分析方法48
• 3.3 結(jié)果48-55
• 3.4 討論55-57
• 第四章 基因多態(tài)性位點rs842647與創(chuàng)傷后外周血白細(xì)胞反應(yīng)性的臨床關(guān)聯(lián)研究57-61
• 4.1 材料與方法57-58
• 4.2 統(tǒng)計學(xué)分析58
• 4.3 結(jié)果58-59
• 4.4 討論59-61
• 全文結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-72
• 文獻(xiàn)綜述一NFKB及其基因多態(tài)性與疾病易感性關(guān)聯(lián)研究進(jìn)展72-97
• 參考文獻(xiàn)84-97
• 文獻(xiàn)綜述二NFKB的激活與腫瘤的聯(lián)系97-115
• 參考文獻(xiàn)102-115
• 附錄115-131
• 攻讀學(xué)位期間研成果131-132
• 致謝132

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