本文關鍵詞：DKD大鼠腎組織中GSK-3β對GSK-Wnt通路與RANKL-NF-κB通路交互作用相關因子調控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:研究DKD大鼠腎組織中GSK-3β對Wnt/β-catenin信號通路與NF-κB信號通路的相關因子OPG、RANKL、OPN及SM22等的調控作用及上述通路的交互作用,并比較應用Li CL與Ar-a014418兩種GSK-3β抑制劑的作用差異。方法:選取健康8周齡SD實驗大鼠40只,適應性喂養(yǎng)2w后,隨機選擇10只為正常對照組(NC組,n=10);其余30只通過腹腔注射鏈脲霉素(STZ)先建立大鼠糖尿病(Diabetes mellitus,DM)模型。予NC組大鼠腹腔注射相同體積的溶劑。DM大鼠成模10w后,檢測大鼠血糖及24h尿微量白蛋白。若連續(xù)三次測血糖均高于16.7mmol/L,24h尿微量白蛋白定量≥30mg/L,或者超過正常組大鼠的10倍,則證實大鼠DKD模型成功。在DKD成模大鼠中隨機選擇10只為DKD模型組(DKD組,n=10);隨機選擇10只為非ATP競爭性GSK-3β抑制劑氯化鋰(lithium chloride,Li Cl)干預組(Li Cl組,n=10)按15mg/kg劑量行腹腔注射Li Cl(隔天1次,連續(xù)10天);其余10只為ATP競爭性GSK-3β抑制劑Ar-a014418干預組(ARA組,n=10)按1mg/kg劑量行腹腔注射Ar-a014418(隔2天1次,連續(xù)10天);其余組給予等體積藥物溶劑注射。分階段檢測血糖、24h尿微量白蛋白。末次腹腔注射結束3d后處死大鼠,留取腎臟組織,分別進行以下實驗:行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)方法觀察腎組織病理改變;應用免疫組化(immunohistochemistry,IHC)En Vision二步法檢測GSK-3β、NF-κBp65、OPN、OPG、RANKL、β-catenin、SM22在腎組織中的表達;采用實時定量-聚合酶鏈反應(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)方法檢測OPN、OPG、RANKL、β-catenin的m RNA在腎組織中的表達水平;應用免疫印跡(Western blot,WB)方法檢測p GSK-3β(ser9),β-catenin,NF-κBp65 and OPN蛋白在腎組織中的表達。結果:1、成功復制大鼠DKD模型并行藥物干預:兩種GSK-3β抑制劑組的一般狀態(tài)和生存率均較DKD組好,生存率(95%)明顯大于DKD組生存率(90%)。2、與NC組相比,DKD、Li Cl組及ARA組血糖、24h尿微量白蛋白均明顯升高;與DKD組相比,Li Cl組與ARA組血糖、24h尿微量白蛋白降低(均P0.05)。3、光鏡顯示:DKD組大鼠腎組織可見腎小球肥大,腎小管上皮細胞水腫明顯,管腔狹窄、閉塞,炎性細胞浸潤等DKD早期病理改變;Li Cl組與ARA組大鼠腎組織上述病理改變均在一定程度上減輕。4、IHC顯示:(1)與NC組相比,DKD組GSK-3β表達明顯增強,與DKD組相比,Li Cl組與ARA組GSK-3β的表達顯著減弱(均P0.05)。(2)與NC組相比,DKD組與兩種GSK-3β抑制劑組均有NF-κBp65增多并核移位,其下游因子OPN的表達隨之上升;但與DKD組相比,Li Cl組與ARA組NF-κB p65及OPN的表達減少,且NF-κB p65核移位減少(均P0.05)。(3)與NC組相比,DKD組NF-κB上游因子OPG及RANKL表達均有增強,但OPG/RANKL比值減小;與DKD組相比,Li Cl組與ARA組RANKL的表達減弱,OPG/RANKL比值增大(均P0.05)。(4)與NC組相比,DKD組與兩種GSK-3β抑制劑組β-catenin表達及核移位均有增強,但ARA組較Li Cl組與DKD組有更顯著差異(均P0.05)。(5)DKD組腎小管部分上皮細胞SM22表達弱陽性,Li Cl組與NC組無顯著差異,ARA干預組SM22表達較其他3組顯著增強。5、RT-q PCR顯示:(1)與NC組相比,DKD組OPN m RNA表達均有增強;但與DKD組相比,Li Cl組與ARA組OPN m RNA表達減弱(均P0.05)。(2)與NC組相比,DKD組OPG與RANKL m RNA表達均有增強,但OPG m RNA/RANKL m RNA比值減小;與DKD組相比,Li Cl組與ARA組OPG及RANKL的表達減弱,但OPG m RNA/RANKL m RNA比值增大(P0.05)。(3)與NC組相比,DKD組與兩種GSK-3β抑制劑組β-catenin m RNA表達均有增強,但ARA組較Li Cl組與DKD組有更顯著差異(均P0.05)。6、Western blot顯示:(1)與NC組相比,DKD組p GSK-3β(ser9)表達減弱,與NC組及DKD組相比,兩種GSK-3β抑制劑組p GSK-3β(ser9)表達均有顯著增強(P0.05)。(2)與NC組相比,DKD組NF-κBp65增多,其下游因子OPN的表達隨之上升;與DKD組相比,Li Cl組與ARA組NF-κB p65及OPN表達減少(均P0.05)。(3)與NC組相比,兩種GSK-3β抑制劑組β-catenin表達增強,但ARA組較Li Cl組與DKD組有更顯著差異(均P0.05)。結論:GSK-3β在DKD大鼠腎組織中至少部分地通過GSK-Wnt信號通路與RANKL-NF-κB信號通路的交互作用正性調控NF-κB信號通路的活性:1.高血糖引發(fā)的DKD大鼠腎組織中活性GSK-3β增多,可上調RANKL、NF-κB、OPN等炎癥損傷關鍵基因,引起腎臟早期病理改變,導致24h尿微量白蛋白量上升,促發(fā)并加重糖尿病腎臟損傷。2.使用GSK-3β抑制劑可通過磷酸化GSK-3β而使之失活,引起β-catenin通路激活,下調RANKL、NF-κB、OPN等炎癥損傷關鍵基因,改善DKD大鼠的一般狀態(tài)及腎臟早期病理改變,并降低DKD大鼠的血糖、24h尿微量白蛋白,在一定程度上能延緩DKD進程;然而,兩種GSK-3β抑制劑在DKD大鼠腎組織中對β-catenin和SM22的作用有明顯的差異:Ar-a014418的作用遠超較Li Cl,可引起的β-catenin濃度急劇上升,可致Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因SM22異常表達。
【關鍵詞】：GSK-3β 調控 DKD Wnt/β-catenin NF-κB 信號通路交互作用 RANKL OPN SM22
【學位授予單位】：貴陽醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R692
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 縮略詞表12-14
• 引言14-20
• 材料與方法20-32
• 結果32-46
• 討論46-56
• 結論56-57
• 創(chuàng)新點57-58
• 參考文獻58-66
• 綜述66-86
• 參考文獻80-86
• 作者簡歷86-88
• 致謝88-89
• 學位論文數(shù)據(jù)集89

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本文編號：265375