本文關(guān)鍵詞：下調(diào)miR-100對(duì)RGC-5的作用及相關(guān)機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的青光眼(glaucoma)造成永久性視神經(jīng)傷害,嚴(yán)重?fù)p害視覺(jué)視功能,是迄今位于全球首位的不可逆性致盲眼病。青光眼的病理特征是病理性眼壓升高,視神經(jīng)的凹陷性萎縮,導(dǎo)致發(fā)生進(jìn)行性視野缺損。但目前關(guān)于青光眼的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前認(rèn)為其發(fā)病可能與機(jī)械壓迫損傷學(xué)說(shuō)以及缺血學(xué)說(shuō)有關(guān)。青光眼發(fā)病過(guò)程的重要危險(xiǎn)因素是病理性眼壓升高,目前對(duì)青光眼治療的主要方法是利用藥物治療或手術(shù)治療降低眼壓,從而減緩青光眼的疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。但在臨床工作中發(fā)現(xiàn),部分青光眼患者的眼壓雖可降低至正常范圍內(nèi),但仍未阻斷視神經(jīng)萎縮的進(jìn)展,且視功能也持續(xù)性減退,因此應(yīng)用藥物治療或其他干預(yù)措施對(duì)視神經(jīng)的保護(hù)治療,抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡,或增加視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活數(shù)目,延長(zhǎng)其存活時(shí)間,是維持青光眼患者的視力,阻止視功能損傷的關(guān)鍵措施。視神經(jīng)的形成主要是由從視網(wǎng)膜各個(gè)方向延伸到視乳頭的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)的軸突纖維而形成,視神經(jīng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞向視覺(jué)中樞傳遞視覺(jué)信號(hào),因此RGCs凋亡是青光眼等眼科疾病的重要病理特征之一。因此研究青光眼等視神經(jīng)損害疾病的發(fā)病機(jī)制主要圍繞RGCs細(xì)胞。對(duì)于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷機(jī)制研究認(rèn)為可能有包括剝奪神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、興奮性氨基酸毒性、鈣超載、以及氧自由基損傷等。而建立RGC-5細(xì)胞系并制備相關(guān)細(xì)胞凋亡模型是研究視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷機(jī)制的關(guān)鍵。高度保守的基因調(diào)節(jié)因子microRNA(miRNA)的出現(xiàn)為疾病診斷、治療提供新的思路。miRNA主要以序列特異性的方式,通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)基因表達(dá),對(duì)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)起抑制作用,參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、代謝及凋亡的調(diào)控。miRNA一般由19-25個(gè)核苷酸組成,長(zhǎng)度為18-22 nt,前體微小RNA由Drosha酶切割成70nt左右的發(fā)夾狀前體,是幾百至幾千nt大小的初級(jí)產(chǎn)物,由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生,pre-miRNA是miRNA的前身,轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì),由RNA酶Ⅲ內(nèi)切酶家族的Dicer酶剪切前體微小RNA形成,從各自的pre-RNA的5'端釋放出來(lái),成為18-22 nt的成熟的單鏈miRNA,發(fā)揮對(duì)靶mRNA降解或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯的作用。研究發(fā)現(xiàn)microRNA與視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miRNAs可能與視網(wǎng)膜色素變性、視神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及視網(wǎng)膜新生血管化等都有關(guān)。microRNA-100(miR-100)是新近研究的MicroRNA成員,目前已發(fā)現(xiàn)其主要與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。目前已發(fā)現(xiàn)miR-100在肝癌、肺癌、鼻咽癌、腎上腺皮質(zhì)腫瘤等多種腫瘤中表達(dá)異常,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生或侵襲。但miR-100在青光眼等眼科疾病中的表達(dá)及其具體作用機(jī)制尚未完全闡明,因此本研究的目的是探討miR-100在RGC-5細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用及機(jī)制。研究方法：1、培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞,分別加入不同濃度100μm、200μm、400μm、500μm、 1000μm過(guò)氧化氫培養(yǎng)24h,制備氧化應(yīng)激損傷模型；MTT法和TUNEL法檢測(cè)RGC-5細(xì)胞凋亡情況；使用Real time PCR檢測(cè)miR-100在正常和不同濃度(100 u、200μm、400μm、500μm、1000μm)過(guò)氧化氫氧化應(yīng)激損傷模型中的表達(dá)。2、選取400μm濃度過(guò)氧化氫制作氧化應(yīng)激模型,利用慢病毒轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑,檢測(cè)抑制miR-100后對(duì)RGC-5細(xì)胞凋亡情況的保護(hù)作用；MTT法和TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況；并用免疫組化分析抑制miR-100后對(duì)氧化應(yīng)激損傷的RGC-5軸突長(zhǎng)度的影響。3、Western blot分析miR-100對(duì)RGC-5細(xì)胞的作用機(jī)制；使用熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-100與GIF1R基因3'UTR的靶向調(diào)節(jié)作用；使用siRNA轉(zhuǎn)染IGF1R蛋白后,用TUNEL法檢測(cè)RGC-5細(xì)胞凋亡情況；使用Western blot分析上述過(guò)程。結(jié)果：1、過(guò)氧化氫所造成的氧化應(yīng)激損傷,使RGC-5細(xì)胞的凋亡率顯著增加,與空白對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；且過(guò)氧化氫造成的氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的RGC-5細(xì)胞的凋亡率具有濃度依賴(lài)性。不論是正常RGC-5細(xì)胞還是氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型中,均可檢測(cè)到miR-100的表達(dá)。但在正常RGC-5細(xì)胞中,miR-100含量非常少,而與正常細(xì)胞的miR-100表達(dá)比較,可見(jiàn)不同濃度過(guò)氧化氫作用的RGC-5細(xì)胞中miR-100均呈表達(dá)上調(diào),與空白對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且隨著過(guò)氧化氫作用濃度的增加,RGC-5細(xì)胞中miR-100表達(dá)進(jìn)一步增加。2、轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑后,可顯著降低氧化應(yīng)激損傷的RGC-5細(xì)胞中miR-100的表達(dá),與對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。氧化損傷模型中,在轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑有效抑制miR-100表達(dá)后,RGC-5細(xì)胞中TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,RGC-5細(xì)胞凋亡率明顯降低,與對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑后,因氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致變圓腫脹的細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng),形態(tài)與正常RGC-5細(xì)胞相似,RGC-5細(xì)胞軸突長(zhǎng)度明顯增加,與對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑后,磷酸化的TrkB、磷酸化的AKT、磷酸化的ERK1/2蛋白表達(dá)增加,與對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。miR-100靶向結(jié)合IGF1R的3'UTR, IGF1R3'UTR熒光素活性明顯降低,且這種活性降低主要見(jiàn)于野生型IGF1R,突變型IGF1R并未見(jiàn)明顯變化,與對(duì)照組以及突變型IGF1R比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。siRNA干擾IGF1R后,使IGF1R表達(dá)減少或抑制,RGC-5 TUNEL染色陽(yáng)性的細(xì)胞明顯減少,其磷酸化的AKT表達(dá)增加。結(jié)論：1.過(guò)氧化氫作用RGC-5細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷,可誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞凋亡,且呈濃度依賴(lài)性。2.miR-100在正常和氧化應(yīng)激損傷的RGC-5細(xì)胞中均表達(dá),且隨著氧化應(yīng)激損傷程度增加而表達(dá)上調(diào),呈濃度依賴(lài)性,說(shuō)明與RGC-5細(xì)胞凋亡相關(guān)。3.下調(diào)miR-100可抑制RGC-5細(xì)胞凋亡,對(duì)RGC-5細(xì)胞起保護(hù)作用。下調(diào)miR-100的表達(dá)可能通過(guò)激活TrkB/AKT/ERK通路發(fā)揮調(diào)節(jié)RGC-5細(xì)胞凋亡及對(duì)RGC-5細(xì)胞的保護(hù)作用。4.下調(diào)miR-100的表達(dá),可能是通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因IGF1R的表達(dá),從而激活TrkB/AKT/ERK通路,減少氧化應(yīng)激后RGC-5細(xì)胞凋亡,發(fā)揮對(duì)RGC-5細(xì)胞的保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：miR-100 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞5 細(xì)胞凋亡 胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R775
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12-19
• 材料和方法19-34
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料19-23
• 1.2 方法23-27
• 1.3 研究指標(biāo)27-33
• 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析33-34
• 結(jié)果34-49
• 2.1 氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致RGC-5細(xì)胞凋亡34-37
• 2.2 抑制miR-100后對(duì)氧化應(yīng)激損傷的RGC-5細(xì)胞的影響37-42
• 2.3 下調(diào)miR-100表達(dá)后對(duì)氧化應(yīng)激損傷RGC-5凋亡影響的相關(guān)機(jī)制分析42-49
• 討論49-54
• 結(jié)論54-55
• 問(wèn)題與展望55-56
• 參考文獻(xiàn)56-64
• 文獻(xiàn)綜述一64-93
• 參考文獻(xiàn)78-93
• 文獻(xiàn)綜述二93-108
• 參考文獻(xiàn)100-108
• 縮略詞108-109
• 致謝109-110
• 成果110-112
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明112

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：下調(diào)miR-100對(duì)RGC-5的作用及相關(guān)機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：263457