本文關鍵詞：下調miR-100對RGC-5的作用及相關機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的青光眼(glaucoma)造成永久性視神經(jīng)傷害,嚴重損害視覺視功能,是迄今位于全球首位的不可逆性致盲眼病。青光眼的病理特征是病理性眼壓升高,視神經(jīng)的凹陷性萎縮,導致發(fā)生進行性視野缺損。但目前關于青光眼的發(fā)病機制尚未闡明。目前認為其發(fā)病可能與機械壓迫損傷學說以及缺血學說有關。青光眼發(fā)病過程的重要危險因素是病理性眼壓升高,目前對青光眼治療的主要方法是利用藥物治療或手術治療降低眼壓,從而減緩青光眼的疾病發(fā)生發(fā)展進程。但在臨床工作中發(fā)現(xiàn),部分青光眼患者的眼壓雖可降低至正常范圍內,但仍未阻斷視神經(jīng)萎縮的進展,且視功能也持續(xù)性減退,因此應用藥物治療或其他干預措施對視神經(jīng)的保護治療,抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡,或增加視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活數(shù)目,延長其存活時間,是維持青光眼患者的視力,阻止視功能損傷的關鍵措施。視神經(jīng)的形成主要是由從視網(wǎng)膜各個方向延伸到視乳頭的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells, RGCs)的軸突纖維而形成,視神經(jīng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞向視覺中樞傳遞視覺信號,因此RGCs凋亡是青光眼等眼科疾病的重要病理特征之一。因此研究青光眼等視神經(jīng)損害疾病的發(fā)病機制主要圍繞RGCs細胞。對于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損傷機制研究認為可能有包括剝奪神經(jīng)營養(yǎng)因子、興奮性氨基酸毒性、鈣超載、以及氧自由基損傷等。而建立RGC-5細胞系并制備相關細胞凋亡模型是研究視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損傷機制的關鍵。高度保守的基因調節(jié)因子microRNA(miRNA)的出現(xiàn)為疾病診斷、治療提供新的思路。miRNA主要以序列特異性的方式,通過轉錄后調控發(fā)揮作用,調節(jié)基因表達,對轉錄后水平的基因表達起抑制作用,參與細胞生長、增殖、分化、代謝及凋亡的調控。miRNA一般由19-25個核苷酸組成,長度為18-22 nt,前體微小RNA由Drosha酶切割成70nt左右的發(fā)夾狀前體,是幾百至幾千nt大小的初級產物,由RNA聚合酶Ⅱ轉錄產生,pre-miRNA是miRNA的前身,轉運至細胞質,由RNA酶Ⅲ內切酶家族的Dicer酶剪切前體微小RNA形成,從各自的pre-RNA的5'端釋放出來,成為18-22 nt的成熟的單鏈miRNA,發(fā)揮對靶mRNA降解或阻遏其轉錄后翻譯的作用。研究發(fā)現(xiàn)microRNA與視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關。miRNAs可能與視網(wǎng)膜色素變性、視神經(jīng)母細胞瘤以及視網(wǎng)膜新生血管化等都有關。microRNA-100(miR-100)是新近研究的MicroRNA成員,目前已發(fā)現(xiàn)其主要與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。目前已發(fā)現(xiàn)miR-100在肝癌、肺癌、鼻咽癌、腎上腺皮質腫瘤等多種腫瘤中表達異常,促進腫瘤的發(fā)生或侵襲。但miR-100在青光眼等眼科疾病中的表達及其具體作用機制尚未完全闡明,因此本研究的目的是探討miR-100在RGC-5細胞凋亡發(fā)生的作用及機制。研究方法：1、培養(yǎng)RGC-5細胞,分別加入不同濃度100μm、200μm、400μm、500μm、 1000μm過氧化氫培養(yǎng)24h,制備氧化應激損傷模型；MTT法和TUNEL法檢測RGC-5細胞凋亡情況；使用Real time PCR檢測miR-100在正常和不同濃度(100 u、200μm、400μm、500μm、1000μm)過氧化氫氧化應激損傷模型中的表達。2、選取400μm濃度過氧化氫制作氧化應激模型,利用慢病毒轉染miR-100抑制劑,檢測抑制miR-100后對RGC-5細胞凋亡情況的保護作用；MTT法和TUNEL染色觀察細胞凋亡情況；并用免疫組化分析抑制miR-100后對氧化應激損傷的RGC-5軸突長度的影響。3、Western blot分析miR-100對RGC-5細胞的作用機制；使用熒光素酶活性實驗檢測miR-100與GIF1R基因3'UTR的靶向調節(jié)作用；使用siRNA轉染IGF1R蛋白后,用TUNEL法檢測RGC-5細胞凋亡情況；使用Western blot分析上述過程。結果：1、過氧化氫所造成的氧化應激損傷,使RGC-5細胞的凋亡率顯著增加,與空白對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；且過氧化氫造成的氧化應激損傷導致的RGC-5細胞的凋亡率具有濃度依賴性。不論是正常RGC-5細胞還是氧化應激損傷的細胞模型中,均可檢測到miR-100的表達。但在正常RGC-5細胞中,miR-100含量非常少,而與正常細胞的miR-100表達比較,可見不同濃度過氧化氫作用的RGC-5細胞中miR-100均呈表達上調,與空白對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),且隨著過氧化氫作用濃度的增加,RGC-5細胞中miR-100表達進一步增加。2、轉染miR-100抑制劑后,可顯著降低氧化應激損傷的RGC-5細胞中miR-100的表達,與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。氧化損傷模型中,在轉染miR-100抑制劑有效抑制miR-100表達后,RGC-5細胞中TUNEL染色陽性細胞明顯減少,RGC-5細胞凋亡率明顯降低,與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。轉染miR-100抑制劑后,因氧化應激損傷導致變圓腫脹的細胞變得細長,形態(tài)與正常RGC-5細胞相似,RGC-5細胞軸突長度明顯增加,與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、轉染miR-100抑制劑后,磷酸化的TrkB、磷酸化的AKT、磷酸化的ERK1/2蛋白表達增加,與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。miR-100靶向結合IGF1R的3'UTR, IGF1R3'UTR熒光素活性明顯降低,且這種活性降低主要見于野生型IGF1R,突變型IGF1R并未見明顯變化,與對照組以及突變型IGF1R比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。siRNA干擾IGF1R后,使IGF1R表達減少或抑制,RGC-5 TUNEL染色陽性的細胞明顯減少,其磷酸化的AKT表達增加。結論：1.過氧化氫作用RGC-5細胞造成氧化應激損傷,可誘導RGC-5細胞凋亡,且呈濃度依賴性。2.miR-100在正常和氧化應激損傷的RGC-5細胞中均表達,且隨著氧化應激損傷程度增加而表達上調,呈濃度依賴性,說明與RGC-5細胞凋亡相關。3.下調miR-100可抑制RGC-5細胞凋亡,對RGC-5細胞起保護作用。下調miR-100的表達可能通過激活TrkB/AKT/ERK通路發(fā)揮調節(jié)RGC-5細胞凋亡及對RGC-5細胞的保護作用。4.下調miR-100的表達,可能是通過調節(jié)其靶基因IGF1R的表達,從而激活TrkB/AKT/ERK通路,減少氧化應激后RGC-5細胞凋亡,發(fā)揮對RGC-5細胞的保護作用。
【關鍵詞】：miR-100 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞5 細胞凋亡 胰島素樣生長因子1受體
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R775
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12-19
• 材料和方法19-34
• 1.1 實驗材料19-23
• 1.2 方法23-27
• 1.3 研究指標27-33
• 1.4 統(tǒng)計學分析33-34
• 結果34-49
• 2.1 氧化應激損傷導致RGC-5細胞凋亡34-37
• 2.2 抑制miR-100后對氧化應激損傷的RGC-5細胞的影響37-42
• 2.3 下調miR-100表達后對氧化應激損傷RGC-5凋亡影響的相關機制分析42-49
• 討論49-54
• 結論54-55
• 問題與展望55-56
• 參考文獻56-64
• 文獻綜述一64-93
• 參考文獻78-93
• 文獻綜述二93-108
• 參考文獻100-108
• 縮略詞108-109
• 致謝109-110
• 成果110-112
• 統(tǒng)計學審稿證明112

【參考文獻】

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本文編號：263457