本文關(guān)鍵詞：RECK基因在人腺樣囊性癌中的表達(dá)、甲基化狀態(tài)及與臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：涎腺腺樣囊性癌為發(fā)生在涎腺的最常見的惡性腫瘤之一,其特點(diǎn)為局部高侵襲性及遠(yuǎn)處較高的轉(zhuǎn)移率,特別是肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移。腫瘤侵犯周圍組織的過程就是腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的過程,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá),可明顯改變腫瘤細(xì)胞入侵周圍正常組織的過程�；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家屬通過降解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分,而在腫瘤侵襲過程中起重要作用,MMP-2是一種比較特異的膠原酶,可特異性的降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜中的V型膠原,從而破壞周圍組織結(jié)構(gòu),并誘導(dǎo)血管生成。Thereversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK)基因蛋白可在正常組織中常見表達(dá),而在腫瘤細(xì)胞中常為無表達(dá)或低表達(dá),RECK基因可通過多種機(jī)制抑制金屬蛋白酶的活性,可以直接抑制活化的MMP-2,進(jìn)而從而很好地抑制MMP-2的活性。DNA甲基化是惡性腫瘤中常見的生物學(xué)現(xiàn)象,抑癌基因的甲基化可導(dǎo)致其表達(dá)的沉默,而癌基因的異常去甲基化可導(dǎo)致其過度表達(dá),目前在涎腺腺樣囊性癌中已有數(shù)個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了相關(guān)研究,然而RECK基因在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及甲基化狀態(tài)仍未見報(bào)道。本研究通過免疫組化方法,檢測(cè)RECK及MMP-2在涎腺腺樣囊性癌組織中的表達(dá),并分析其表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系,旨在檢測(cè)其表達(dá)在腺樣囊性癌進(jìn)展中的意義；采用甲基化特異性PCR檢測(cè)腺樣囊性癌細(xì)胞株中RECK基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)；采用Qrt-PCR及western blot檢測(cè)經(jīng)5-aza-dC處理后的腺樣囊性癌細(xì)胞株,RECK基因mRNA及蛋白表達(dá)的改變情況；采用transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腺樣囊性癌細(xì)胞株經(jīng)藥物作用后侵襲力的變化,為其生物學(xué)治療提供新的可能。方法：1.收集臨床涎腺腺樣囊性癌組織蠟塊83例及臨床有關(guān)資料,采用免疫組織化學(xué)染色方法觀察RECK及MMP-2蛋白在涎腺腺樣囊性癌組織的表達(dá),并對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)分,評(píng)估RECK及MMP-2的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、臨床分期、組織學(xué)分類、神經(jīng)侵犯等的相關(guān)性。2.采用卡方檢驗(yàn)方法,驗(yàn)證RECK及MMP-2蛋白在涎腺腺樣囊性癌組織及癌旁正常組織中表達(dá)的相關(guān)性。3.采用Kaplan-Meier生存分析方法檢驗(yàn)RECK陽性表達(dá)患者及RECK陰性表達(dá)患者累計(jì)生存率的差別。4.采用單因素及多因素回歸分析,檢測(cè)對(duì)患者累計(jì)生存率有判定意思的臨床病理及蛋白指標(biāo)。5.采用甲基化特性性PCR檢測(cè)人腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-2、ACC-M中RECK基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài),并采用不用濃度的5-aza-dC處理人腺樣囊性癌細(xì)胞株不同時(shí)間,查看RECK基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)的改變情況。6.采用實(shí)時(shí)定量PCR及western blot檢測(cè)經(jīng)不用濃度5-aza-dC作用人腺樣囊性癌細(xì)胞株不同時(shí)間后,RECK基因mRNA及蛋白表達(dá)的改變情況。7.采用transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè),經(jīng)不同濃度5-aza-dC處理人腺樣囊性癌細(xì)胞株72小時(shí),檢測(cè)該細(xì)胞株侵襲力的改變情況,結(jié)果：1.免疫組化結(jié)果顯示,在涎腺腺樣囊性癌組織中,RECK表達(dá)陰性或者呈弱表達(dá),而MMP-2多為高表達(dá)；癌旁正常組織臨床樣本中,RECK基因多高表達(dá),而MMP-2多為低表達(dá)或不表達(dá)；通過臨床資料統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),在涎腺腺樣囊性癌中RECK蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小無關(guān),與TNM分期、病理類型、及神經(jīng)侵犯顯著相關(guān),而MMP-2與TNM分期及神經(jīng)侵犯顯著相關(guān),而與病理類型無明顯相關(guān)。2.在RECK蛋白陽性(+、++)表達(dá)的組織中,MMP-2的陽性表達(dá)率為45.5%(10/22),而在RECK蛋白陰性(-)表達(dá)的組織中,MMP-2的陽性表達(dá)率為95.2%(59/62), Pearson's χ2結(jié)果顯示RECK在腺樣囊性癌組織中的表達(dá)與MMP-2的表達(dá)成明顯負(fù)相關(guān)(x2=38.202,p=0.000)。3.腺樣囊性癌術(shù)后患者的隨訪時(shí)限平均為54個(gè)月(范圍,10-120月),42名患者死于腺樣囊性癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,5名患者失訪,4名患者(4.2%)死于其他疾患,32名患者(44.4%)到隨訪截止日仍存活。生存曲線顯示,RECK陽性表達(dá)的患者的總體生存率明顯高于陰性表達(dá)者(p=.004)4.單因素Cox回歸模型分析顯示RECK、MMP-2、病理類型、TNM分期、神經(jīng)侵犯與患者預(yù)后顯著相關(guān),而多因素cox回歸模型顯示只有RECK表達(dá)及病理類型是患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)(P=0.043)5.甲基化特異性PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ACC-M細(xì)胞株中可見非甲基化及較強(qiáng)的甲基化條,而ACC-2細(xì)胞株中僅可見較強(qiáng)的非甲基化條帶,經(jīng)5-aza-dC處理后ACC-M細(xì)胞中RECK基因甲基化狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)。6.實(shí)時(shí)定量PCR及western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),經(jīng)5-aza-dC處理后,ACC-M細(xì)胞中RECK基因mRNA及蛋白的表達(dá)得到顯著提升。7. transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),經(jīng)5-aza-dC處理后ACC-M細(xì)胞株72小時(shí)后。ACC-M細(xì)胞株的侵襲力明顯降低結(jié)論：RECK在涎腺腺樣囊性癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織,低表達(dá)的RECK與涎腺腺樣囊性癌的臨床分期及組織學(xué)類型、神經(jīng)侵犯相關(guān)；RECK基因?qū)ο严傧贅幽倚园┑囊种谱饔每赡苁峭ㄟ^抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2的活性,從而提高了患者的累計(jì)生存率,RECK的檢測(cè)可作為涎腺腺樣囊性癌臨床診斷、判斷預(yù)后、診療方案制定及潛在生物標(biāo)記物和分子指標(biāo)。甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC可明顯提高RECK基因mRNA及蛋白的表達(dá),并明顯降低腺樣囊性癌細(xì)胞系的侵襲力,其機(jī)制可能為藥物恢復(fù)了金屬蛋白酶抑制劑RECK的表達(dá)有關(guān),這為涎腺腺樣囊性癌的生物治療提供了新的可能。
【關(guān)鍵詞】：涎腺腺樣囊性癌 RECK 預(yù)后 甲基化 transwell侵襲實(shí)驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.8
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-16
• 符號(hào)說明16-17
• 第一章 RECK基因在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及與患者預(yù)后的相關(guān)性研究17-33
• 前言17-18
• 材料與方法18-20
• 結(jié)果20-21
• 討論21-24
• 附圖24-30
• 參考文獻(xiàn)30-33
• 第二章 涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞中RECK基因甲基化水平的研究33-44
• 前言33
• 材料與方法33-36
• 結(jié)果36
• 討論36-38
• 附圖38-39
• 附表39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 第三章 5-氮雜-2'-脫氧胞苷對(duì)人腺樣囊性癌細(xì)胞RECK基因表達(dá)及腫瘤侵襲力的影響44-61
• 前言44-45
• 材料和方法45-53
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-54
• 討論54-56
• 附圖56-59
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 致謝61-62
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的文章62-63
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表63-64
• 英文論文一64-82
• 英文論文二82-101

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4 邵U，

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