本文關鍵詞：RECK基因在人腺樣囊性癌中的表達、甲基化狀態(tài)及與臨床病理因素及預后的相關性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：涎腺腺樣囊性癌為發(fā)生在涎腺的最常見的惡性腫瘤之一,其特點為局部高侵襲性及遠處較高的轉移率,特別是肺轉移、肝轉移及骨轉移。腫瘤侵犯周圍組織的過程就是腫瘤細胞與細胞外基質相互作用的過程,通過調節(jié)細胞外基質蛋白的表達,可明顯改變腫瘤細胞入侵周圍正常組織的過程�；|金屬蛋白酶(MMP)家屬通過降解基底膜及細胞外基質的主要組分,而在腫瘤侵襲過程中起重要作用,MMP-2是一種比較特異的膠原酶,可特異性的降解細胞外基質及基底膜中的V型膠原,從而破壞周圍組織結構,并誘導血管生成。Thereversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK)基因蛋白可在正常組織中常見表達,而在腫瘤細胞中常為無表達或低表達,RECK基因可通過多種機制抑制金屬蛋白酶的活性,可以直接抑制活化的MMP-2,進而從而很好地抑制MMP-2的活性。DNA甲基化是惡性腫瘤中常見的生物學現(xiàn)象,抑癌基因的甲基化可導致其表達的沉默,而癌基因的異常去甲基化可導致其過度表達,目前在涎腺腺樣囊性癌中已有數(shù)個抑癌基因啟動子的甲基化狀態(tài)進行了相關研究,然而RECK基因在涎腺腺樣囊性癌中的表達及甲基化狀態(tài)仍未見報道。本研究通過免疫組化方法,檢測RECK及MMP-2在涎腺腺樣囊性癌組織中的表達,并分析其表達與臨床病理因素之間的關系,旨在檢測其表達在腺樣囊性癌進展中的意義；采用甲基化特異性PCR檢測腺樣囊性癌細胞株中RECK基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)；采用Qrt-PCR及western blot檢測經(jīng)5-aza-dC處理后的腺樣囊性癌細胞株,RECK基因mRNA及蛋白表達的改變情況；采用transwell侵襲實驗檢測腺樣囊性癌細胞株經(jīng)藥物作用后侵襲力的變化,為其生物學治療提供新的可能。方法：1.收集臨床涎腺腺樣囊性癌組織蠟塊83例及臨床有關資料,采用免疫組織化學染色方法觀察RECK及MMP-2蛋白在涎腺腺樣囊性癌組織的表達,并對免疫組化結果進行評分,評估RECK及MMP-2的表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小、臨床分期、組織學分類、神經(jīng)侵犯等的相關性。2.采用卡方檢驗方法,驗證RECK及MMP-2蛋白在涎腺腺樣囊性癌組織及癌旁正常組織中表達的相關性。3.采用Kaplan-Meier生存分析方法檢驗RECK陽性表達患者及RECK陰性表達患者累計生存率的差別。4.采用單因素及多因素回歸分析,檢測對患者累計生存率有判定意思的臨床病理及蛋白指標。5.采用甲基化特性性PCR檢測人腺樣囊性癌細胞系ACC-2、ACC-M中RECK基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài),并采用不用濃度的5-aza-dC處理人腺樣囊性癌細胞株不同時間,查看RECK基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)的改變情況。6.采用實時定量PCR及western blot檢測經(jīng)不用濃度5-aza-dC作用人腺樣囊性癌細胞株不同時間后,RECK基因mRNA及蛋白表達的改變情況。7.采用transwell侵襲實驗檢測,經(jīng)不同濃度5-aza-dC處理人腺樣囊性癌細胞株72小時,檢測該細胞株侵襲力的改變情況,結果：1.免疫組化結果顯示,在涎腺腺樣囊性癌組織中,RECK表達陰性或者呈弱表達,而MMP-2多為高表達；癌旁正常組織臨床樣本中,RECK基因多高表達,而MMP-2多為低表達或不表達；通過臨床資料統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),在涎腺腺樣囊性癌中RECK蛋白的表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小無關,與TNM分期、病理類型、及神經(jīng)侵犯顯著相關,而MMP-2與TNM分期及神經(jīng)侵犯顯著相關,而與病理類型無明顯相關。2.在RECK蛋白陽性(+、++)表達的組織中,MMP-2的陽性表達率為45.5%(10/22),而在RECK蛋白陰性(-)表達的組織中,MMP-2的陽性表達率為95.2%(59/62), Pearson's χ2結果顯示RECK在腺樣囊性癌組織中的表達與MMP-2的表達成明顯負相關(x2=38.202,p=0.000)。3.腺樣囊性癌術后患者的隨訪時限平均為54個月(范圍,10-120月),42名患者死于腺樣囊性癌復發(fā)或轉移,5名患者失訪,4名患者(4.2%)死于其他疾患,32名患者(44.4%)到隨訪截止日仍存活。生存曲線顯示,RECK陽性表達的患者的總體生存率明顯高于陰性表達者(p=.004)4.單因素Cox回歸模型分析顯示RECK、MMP-2、病理類型、TNM分期、神經(jīng)侵犯與患者預后顯著相關,而多因素cox回歸模型顯示只有RECK表達及病理類型是患者預后的獨立指標(P=0.043)5.甲基化特異性PCR檢測發(fā)現(xiàn),ACC-M細胞株中可見非甲基化及較強的甲基化條,而ACC-2細胞株中僅可見較強的非甲基化條帶,經(jīng)5-aza-dC處理后ACC-M細胞中RECK基因甲基化狀態(tài)得到逆轉。6.實時定量PCR及western blot檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)5-aza-dC處理后,ACC-M細胞中RECK基因mRNA及蛋白的表達得到顯著提升。7. transwell侵襲實驗檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)5-aza-dC處理后ACC-M細胞株72小時后。ACC-M細胞株的侵襲力明顯降低結論：RECK在涎腺腺樣囊性癌組織中的表達明顯低于癌旁正常組織,低表達的RECK與涎腺腺樣囊性癌的臨床分期及組織學類型、神經(jīng)侵犯相關；RECK基因對涎腺腺樣囊性癌的抑制作用可能是通過抑制基質金屬蛋白酶-2的活性,從而提高了患者的累計生存率,RECK的檢測可作為涎腺腺樣囊性癌臨床診斷、判斷預后、診療方案制定及潛在生物標記物和分子指標。甲基化轉移酶抑制劑5-aza-dC可明顯提高RECK基因mRNA及蛋白的表達,并明顯降低腺樣囊性癌細胞系的侵襲力,其機制可能為藥物恢復了金屬蛋白酶抑制劑RECK的表達有關,這為涎腺腺樣囊性癌的生物治療提供了新的可能。
【關鍵詞】：涎腺腺樣囊性癌 RECK 預后 甲基化 transwell侵襲實驗
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.8
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-16
• 符號說明16-17
• 第一章 RECK基因在涎腺腺樣囊性癌中的表達及與患者預后的相關性研究17-33
• 前言17-18
• 材料與方法18-20
• 結果20-21
• 討論21-24
• 附圖24-30
• 參考文獻30-33
• 第二章 涎腺腺樣囊性癌細胞中RECK基因甲基化水平的研究33-44
• 前言33
• 材料與方法33-36
• 結果36
• 討論36-38
• 附圖38-39
• 附表39-40
• 參考文獻40-44
• 第三章 5-氮雜-2'-脫氧胞苷對人腺樣囊性癌細胞RECK基因表達及腫瘤侵襲力的影響44-61
• 前言44-45
• 材料和方法45-53
• 實驗結果53-54
• 討論54-56
• 附圖56-59
• 參考文獻59-61
• 致謝61-62
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的文章62-63
• 學位論文評閱及答辯情況表63-64
• 英文論文一64-82
• 英文論文二82-101

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