本文關(guān)鍵詞：CARD6對(duì)心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的作用及其機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景心肌肥厚是一種復(fù)雜的并且合并眾多因素參與調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)過(guò)程,同時(shí)也是高血壓病、瓣膜病、心肌病、心肌梗死等大多心血管疾病共同經(jīng)歷的病理過(guò)程。心肌肥厚是對(duì)血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷、血管緊張素、生長(zhǎng)因子以及激素等多種心血管刺激因素所做出的適應(yīng)性代償反應(yīng),它能夠使心室壁壓力降低,維持甚至可以提高心臟排血量,然而長(zhǎng)期的應(yīng)激將會(huì)導(dǎo)致持續(xù)性病理性心肌肥大,并伴隨有心臟形態(tài)和功能上的惡化,表現(xiàn)出炎癥、纖維化及異�；虮磉_(dá)等變化,最終會(huì)導(dǎo)致心肌缺血、惡性心律失常、心力衰竭甚至猝死。因此,發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)心肌肥厚的特異性分子及信號(hào)通路,對(duì)于進(jìn)一步闡明心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,從細(xì)胞分子水平上調(diào)控心肌肥厚的病理生理進(jìn)程,為防治心力衰竭提供新的靶點(diǎn)和新的治療策略,具有非常重要的理論和臨床意義。胱天蛋白酶募集域蛋白6(caspase recruitment domain protein 6,CARD6)作為CARDs家族的重要成員之一,它與蛋白激酶RIP家族成員形成復(fù)合體,作為NOD樣受體(Nod-like receptors,NLRs)及TLR樣受體(Toll-like receptors,TLRs)通路的重要媒介物,激活NF-κB等信號(hào)通路,在機(jī)體先天性及后天性免疫反應(yīng)和炎癥應(yīng)答等方面起重要調(diào)控作用。Northern分析表明,CARD6廣泛存在于哺乳動(dòng)物的器官組織中,包括心臟和骨骼肌組織中。然而對(duì)CARD6的功能研究,包括在心血管疾病中的研究,尤其在心肌肥厚中,目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本課題主要通過(guò)建立小鼠心肌肥厚模型,觀察CARD6在心肌肥厚中的表達(dá)變化,運(yùn)用心臟特異性CARD6基因敲除及轉(zhuǎn)基因小鼠,以探討CARD6在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中的作用,并進(jìn)一步闡明其可能的分子機(jī)制。研究方法第一部分:選取體重24~26g、10~12周齡的雄性C57BL/6為背景的野生型(wild type,WT)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,應(yīng)用主動(dòng)脈縮窄(aortic banding,AB)方法制備壓力性負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚動(dòng)物模型。將小鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(sham)、模型組(ab)術(shù)后2周、4周和8周。首先應(yīng)用real-timepcr對(duì)心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物(anp、bnp、β-mhc)的mrna表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)采用real-timepcr、westernblot檢測(cè)ab手術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織中card6mrna和蛋白表達(dá)水平。第二部分:選取體重在24-26g、10-12周齡的雄性c57bl/6為背景的card6-flox對(duì)照組小鼠、心臟特異性card6基因敲除小鼠(ccard6-ko)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,建立壓力性負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型,card6-flox和ccard6-ko小鼠分別隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)和模型組(ab),并且在術(shù)后4周檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。首先用超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)小鼠心臟結(jié)構(gòu)和心臟功能;取材觀察小鼠心臟大體形態(tài),并計(jì)算心臟重量與體重(hw/bw)的比值、肺臟重量與體重(lw/bw)的比值及心臟重量與脛骨長(zhǎng)度(hw/tl)的比值;病理學(xué)檢測(cè)行he及wga染色觀察心肌細(xì)胞橫截面積,psr染色觀察心肌間質(zhì)及周?chē)苣z原纖維含量;通過(guò)real-timepcr檢測(cè)心肌肥厚標(biāo)志物(anp、bnp、β-mhc)以及心肌纖維化標(biāo)志物(collageniα、collageniii、ctgf)的mrna表達(dá)水平。第三部分:應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù),構(gòu)建心臟特異card6轉(zhuǎn)基因(tg)小鼠。選取體重在24-26g、10-12周齡的雄性c57bl/6為背景的非轉(zhuǎn)基因小鼠(ntg)及心臟特異性card6轉(zhuǎn)基因小鼠(tg)建立小鼠心肌肥厚模型,隨機(jī)分為sham組和ab組。在ab術(shù)后4周,超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能;取材觀察心臟大體形態(tài),并計(jì)算hw/bw、lw/bw及hw/tl的比值;he及wga染色觀察心肌細(xì)胞橫截面積,psr染色觀察心肌間質(zhì)及周?chē)苣z原纖維含量;real-timepcr檢測(cè)心肌肥厚標(biāo)志物(anp、bnp、β-mhc)以及心肌纖維化標(biāo)志物(collageniα、collageniii、ctgf)的mrna表達(dá)水平。第四部分:以重組腺病毒載體adshcard6和adcard6感染培養(yǎng)的原代大鼠心肌細(xì)胞,分別以adshrna和adgfp作為對(duì)照,再分別予以pbs、血管緊張素ii(angii,1μmol/l)加入刺激48小時(shí)后,使用免疫熒光(抗肌球蛋白重鏈的單克隆抗體,α-actinin)染色法對(duì)心肌細(xì)胞肥大程度進(jìn)行評(píng)價(jià),并應(yīng)用real-timepcr方法對(duì)心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物(anp、β-mhc)的mrna表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。第五部分:應(yīng)用westernblot方法進(jìn)一步分別檢測(cè)各組小鼠心肌組織中心肌肥厚相關(guān)信號(hào)通路的蛋白表達(dá)情況。研究結(jié)果第一部分:在c57bl/6小鼠心肌肥厚模型中,心力衰竭指標(biāo)anp,bnp及β-mhc的mrna水平逐漸升高,同時(shí)real-timepcr和westernblot結(jié)果顯示,與假手術(shù)組(sham)相比,ab術(shù)后2周小鼠的心臟組織card6的mrna和蛋白水平均開(kāi)始逐漸升高,在4周時(shí)達(dá)到最高峰,至8周時(shí)開(kāi)始降低。第二部分:在card6-flox和ccard6-ko小鼠心肌肥厚模型中,超聲動(dòng)圖檢測(cè)顯示,ccard6-ko小鼠反映心肌肥厚的指標(biāo)左室舒張末內(nèi)徑(lvedd)、左室收縮末內(nèi)徑(lvesd)均大于card6-flox小鼠,同時(shí)心功能的指標(biāo)短軸收縮率(fs%)降低的程度明顯大于card6-flox小鼠;取材發(fā)現(xiàn),ccard6-ko小鼠的hw/bw、lw/bw及hw/tl的比值均高于card6-flox小鼠;he、wga和psr染色顯示ccard6-ko小鼠心肌細(xì)胞面積和纖維化程度較card6-flox小鼠明顯增加,且real-timepcr結(jié)果顯示ccard6-ko小鼠心肌組織中anp、bnp、β-mhc和collageniα、collageniii、ctgf的mrna表達(dá)水平均較card6-flox小鼠升高。第三部分:我們利用顯微注射技術(shù)成功構(gòu)建了以c57bl/6為背景的心臟特異性card6轉(zhuǎn)基因小鼠。在ntg和tg小鼠心肌肥厚模型中,與基因敲除組明顯不同的是,轉(zhuǎn)基因小鼠則表現(xiàn)出相反的結(jié)果。超聲結(jié)果顯示,與ntg組小鼠相比,tg組小鼠反映心肌肥厚(lvedd、lvesd)和心功能(fs%)的指標(biāo)得到顯著改善。取材結(jié)果顯示,與ntg組相比,tg組hw/bw、lw/bw及hw/tl的比值明顯降低;he、wga和psr染色發(fā)現(xiàn),與ntg組小鼠相比,TG組小鼠心肌細(xì)胞面積和纖維化程度明顯減少,且TG組小鼠心肌組織中ANP、BNP、β-MHC和Collagen Iα、Collagen III、CTGF的mRNA表達(dá)水平均顯著降低。第四部分:體外研究結(jié)果顯示,在Ang II(1μmol/L)刺激48小時(shí)后,腺病毒AdshCARD6感染原代大鼠心肌細(xì)胞后,培養(yǎng)的心肌細(xì)胞面積明顯增大,同時(shí)心肌細(xì)胞中的心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANP、β-MHC的mRNA表達(dá)水平均明顯升高。而AdCARD6轉(zhuǎn)染細(xì)胞的以上檢測(cè)指標(biāo)均比AdGFP組明顯降低。第五部分:Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在AB術(shù)后4周,CARD6基因敲除(KO)組心肌組織及心肌細(xì)胞中的MAPK家族成員MEKK1及其下游因子MEK-ERK1/2和JNK1/2的蛋白磷酸化水平明顯增加,而CARD6基因過(guò)表達(dá)(TG)組的蛋白磷酸化水平則顯著降低。結(jié)論通過(guò)主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立壓力性負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型,我們發(fā)現(xiàn)心臟特異性CARD6基因敲除促進(jìn)了心肌肥厚和心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展,而特異過(guò)表達(dá)CARD6則抑制了心肌肥厚和纖維化。同時(shí),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CARD6作用于MAPK家族成員MEKK1并抑制其下游因子MEK-ERK1/2和JNK1/2介導(dǎo)的心肌肥厚信號(hào)通路的激活。
【關(guān)鍵詞】：CARD6 心肌肥厚 基因敲除 轉(zhuǎn)基因 MAPK
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R542.2
【目錄】：

• 英文縮略詞對(duì)照表4-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-20
• 第一部分 CARD6在心肌肥厚模型不同時(shí)期心肌組織中的表達(dá)20-41
• 前言20-21
• 材料與方法21-37
• 結(jié)果37-39
• 討論39
• 結(jié)論39-41
• 第二部分 CARD6基因敲除在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中的作用41-61
• 材料和方法41-52
• 結(jié)果52-59
• 討論59-60
• 結(jié)論60-61
• 第三部分 CARD6基因過(guò)表達(dá)在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中的作用61-82
• 材料和方法61-73
• 結(jié)果73-80
• 討論80-81
• 結(jié)論81-82
• 第四部分 CARD6對(duì)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞肥大的作用82-94
• 材料和方法82-89
• 結(jié)果89-92
• 討論92-93
• 結(jié)論93-94
• 第五部分 CARD6在心肌肥厚中分子機(jī)制的探索94-102
• 前言94-95
• 材料和方法95-96
• 結(jié)果96-100
• 討論100-101
• 結(jié)論101-102
• 全文總結(jié)102-103
• 參考文獻(xiàn)103-107
• 綜述107-120
• 參考文獻(xiàn)115-120
• 攻讀學(xué)位期間成果120-122
• 致謝122

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本文編號(hào)：262656