本文關(guān)鍵詞：ADAR1缺失損傷內(nèi)皮細胞功能及其機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景隨著人們生活水平的提高,我國居民心血管疾病的發(fā)病率顯著增加。血管內(nèi)皮細胞是指襯于整個血管系統(tǒng)內(nèi)表面的單層上皮細胞,它不但是血管壁與血液的天然屏障,更具有維持循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的功能。重大的心血管疾病(如高血壓、冠心病等)都與血管內(nèi)皮細胞調(diào)控功能障礙和損傷相關(guān)。因此,闡明血管內(nèi)皮細胞功能障礙的機制對于防治重大心血管疾病具有重要意義。RNA腺苷脫氨酶(Adenosine deaminases that act on RNA, ADAR)是能將RNA中腺苷酸(Adenosine)轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤核苷(Inosine)的RNA A-I編輯酶。ADAR1是哺乳動物細胞中具有編輯酶活性的脫氨酶之一,它已經(jīng)被證明在胚胎發(fā)育、病毒感染、腫瘤的發(fā)生以及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。許多具有重要生理功能的蛋白質(zhì)都受到RNA A-I編輯的調(diào)控,但目前關(guān)于ADAR1對內(nèi)皮細胞功能的影響及其機制尚不明了。ADAR1基因敲除小鼠胚胎呈白色、血管樣結(jié)構(gòu)減少,提示ADAR1敲除影響小鼠胚胎血管發(fā)育。然而,ADAR1如何影響內(nèi)皮功能缺乏深入的研究,其具體分子機制有待闡明。研究目的本課題以ADAR1為中心,試圖闡明ADAR1缺失對內(nèi)皮細胞功能改變的影響及其機制。我們推測內(nèi)皮細胞ADAR1對于維持血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)是不可或缺的。1.在體外利用siRNA干擾內(nèi)皮細胞ADAR1表達,檢測與分析內(nèi)皮細胞小管形成、細胞滲透性以及內(nèi)皮細胞相關(guān)功能蛋白質(zhì)的表達水平,探索ADAR1對內(nèi)皮細胞功能的影響及其機制。2.觀察血管內(nèi)皮細胞特異性ADAR1基因敲除小鼠表型,檢測條件性敲除小鼠血管滲透性和血管新生功能,初步探討ADAR1對血管內(nèi)皮功能的影響,以了解ADAR1對于血管穩(wěn)態(tài)維持的重要作用及其調(diào)控機制。研究方法利用ADAR1flox/flox小鼠和VE-Cadherin-Cre小鼠雜交培育生成ADAR1flox/flox,Cre/+小鼠,即內(nèi)皮細胞特異性ADAR1基因敲除小鼠；ADAR1flox/flox,Cre/-小鼠作為野生型對照小鼠。體外細胞實驗利用ADAR1 siRNA干擾人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)作為ADAR1基因沉默細胞模型。應(yīng)用HE染色、免疫組織化學(xué)法、免疫熒光法和透射電鏡觀察內(nèi)皮細胞特異性ADAR1基因敲除小鼠病理學(xué)改變；應(yīng)用伊文氏蘭(Evans blue, EB)滲透性方法評估細胞和小鼠血管ADAR1缺失后滲透性變化；應(yīng)用下肢缺血模型和主動脈環(huán)血管生成實驗評價內(nèi)皮細胞特異性ADAR1基因敲除小鼠血管新生功能；應(yīng)用Western Blot法和細胞免疫熒光法檢測ADAR1缺失后內(nèi)皮細胞功能相關(guān)蛋白表達水平的變化。研究結(jié)果1.通過ADAR1 siRNA基因沉默HUVECs ADARl表達觀察其對內(nèi)皮細胞功能的影響。結(jié)果表明與對照siRNA相比,ADAR1 siRNA顯著抑制HUVECs增殖、小管形成功能,同時顯著增加細胞滲透性。2.通過免疫印跡法和免疫熒光法檢測了ADAR1 siRNA對內(nèi)皮細胞功能相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果表明Caveolin-1在ADAR1 siRNA干預(yù)后表達顯著低于對照siRNA組,而VEGFs Sprouty 2、p-eNOS和MMP-9在兩組間均無顯著差異。此外,ADAR1 siRNA顯著抑制Caveolin家族另一亞型Caveolin-2和Caveolin-1下游蛋白VE-cadherin的表達。3.用胞膜通透的Caveolin-1類似物-Cavtratin預(yù)處理HUVECs顯著緩解ADAR1 siRNA對HUVECs小管形成和細胞滲透性的損傷作用,并上調(diào)Caveolin-1下游蛋白VE-cadherin的表達。4.利用Flox/Cre系統(tǒng)成功培育出內(nèi)皮細胞特異性ADAR1基因敲除小鼠。觀察該小鼠表型發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮特異性ADAR1敲除會導(dǎo)致小鼠出生后4周內(nèi)死亡75%。病理學(xué)檢查各臟器發(fā)現(xiàn),ADAR1內(nèi)皮特異性敲除小鼠肺臟組織肺泡上皮增生,部分肺泡腔內(nèi)出血,間質(zhì)炎細胞浸潤,肺間質(zhì)增厚。而與野生型小鼠相比,頸動脈、主動脈、心臟、肝臟和腎臟均無明顯改變。5.透射電鏡觀察肺臟內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn)ADAR1內(nèi)皮特異性敲除小鼠肺血管內(nèi)皮細胞細胞間間隙增寬。Evans Blue血管滲透性檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮特異性敲除ADAR1增加小鼠肺臟血管滲透性。通過免疫印跡法和免疫熒光法檢測肺臟發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠肺臟Caveolin-1/VE-cadherin表達較野生型小鼠顯著下降。6.通過主動脈環(huán)血管形成實驗和下肢缺血模型檢測小鼠血管新生功能。結(jié)果表明內(nèi)皮細胞缺失ADAR1顯著抑制小鼠胸主動脈血管形成;與野生型小鼠相比,內(nèi)皮特異性ADAR1敲除小鼠下肢缺血后血流恢復(fù)顯著抑制,并且模型組下肢肌肉缺血后血管新生明顯受到抑制。結(jié)論1. ADAR1 siRNA可抑制內(nèi)皮細胞小管形成和增加細胞滲透性。2. ADAR1 siRNA損傷內(nèi)皮細胞功能與抑制Caveolin-1/VE-cadherin表達有關(guān)；Cavtratin可逆轉(zhuǎn)ADAR1 siRNA對內(nèi)皮細胞的損傷作用。3. ADAR1內(nèi)皮細胞特異性敲除小鼠因肺損傷而導(dǎo)致小鼠出生后部分死亡。4. ADAR1內(nèi)皮細胞特異性敲除可增加小鼠血管滲透性,抑制下肢缺血后血流恢復(fù)和主動脈環(huán)血管形成功能。5. ADAR1內(nèi)皮細胞特異性敲除可抑制肺臟血管Caveolin-1/VE-cadherin的表達。我們在這項研究中發(fā)現(xiàn)ADAR1敲除增加血管滲透性、抑制血管新生同時抑制Caveolin-1/VE-cadherin的表達。本課題的完成提示ADAR1在內(nèi)皮完整性和血管新生中起到重要作用,并且可能為血管內(nèi)皮損傷性疾病的治療提供新的治療靶點。
【關(guān)鍵詞】：ADAR1 內(nèi)皮細胞 血管新生 細胞滲透性 小窩蛋白1
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 英文縮寫表14-16
• 前言16-18
• 材料和方法18-29
• (一) 實驗材料18-20
• (二) 實驗儀器20
• (三) 主要試劑配置20-22
• (四) 實驗動物22
• (五) 實驗方法22-29
• 實驗結(jié)果29-45
• (一) ADAR1 siRNA損傷內(nèi)皮細胞增殖和小管形成能力、增加細胞滲透性29-30
• (二) ADAR1 siRNA下調(diào)內(nèi)皮細胞Caveolin-1和VE-Cadherin蛋白表達30-32
• (三) Cavtratin顯著緩解ADAR1 siRNA對HUVECs的損傷作用32-34
• (四) ADAR1內(nèi)皮特異性敲除小鼠的培育與鑒定34-36
• (五) ADAR1內(nèi)皮特異性敲除小鼠表型36-39
• (六) ADAR1內(nèi)皮特異性敲除小鼠血管滲透性增加、Caveolin-1和VE-Cadherin蛋白表達下調(diào)39-41
• (七) ADAR1內(nèi)皮特異性敲除損傷小鼠主動脈環(huán)血管新生41-42
• (八) ADAR1內(nèi)皮特異性敲除小鼠下肢缺血模型血管新生和血流恢復(fù)受損42-43
• (九) ADAR1影響內(nèi)皮細胞Caveolin-1表達改變不依賴于IFN-α43-45
• 討論45-48
• 結(jié)論48-49
• METOPROLOL改善糖尿病內(nèi)皮祖細胞功能及其機制研究49-79
• 摘要49-51
• ABSTRACT51-53
• 英文縮略詞53-54
• 前言54-56
• 材料和方法56-64
• 實驗結(jié)果64-75
• (一) 小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細胞的鑒定64-65
• (二) STZ糖尿病小鼠一般情況65
• (三) 不同β受體阻滯劑對內(nèi)皮細胞小管形成和遷移的影響65-66
• (四) 不同β受體阻滯劑對內(nèi)皮祖細胞小管形成和遷移的影響66-67
• (五) Metoprolol改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細胞小管形成和遷移功能67
• (六) Metoprolol改善糖尿病小鼠外周血EPCs數(shù)量和BM-EPCs遷移功能67-69
• (七) Metoprolol對高糖及糖尿病小鼠BM-EPCs內(nèi)O_2~-水平的影響69-70
• (八) Metoprolol增加糖尿病小鼠BM-EPCs eNOS磷酸化70-71
• (九) Metoprolol對糖尿病小鼠傷口愈合的影響71-73
• (十) Metoprolol顯著改善糖尿病小鼠傷口血管新生73-75
• 討論75-78
• 結(jié)論78-79
• 綜述 RNA編輯酶ADAR1在哺乳動物細胞中研究進展79-87
• 英文論文87-98
• 參考文獻98-112
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果112-113
• 致謝113

  本文關(guān)鍵詞：ADAR1缺失損傷內(nèi)皮細胞功能及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：261534