本文關鍵詞：Wee1激酶抑制劑MK-1775抗急性淋巴細胞白血病的效應及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：急性淋巴細胞白血病(ALL)是一種發(fā)生于淋巴造血組織的常見惡性腫瘤,嚴重威脅人類健康。成人ALL預后一般較差,目前常采用的聯(lián)合化療雖然能使病情獲得緩解,但多數(shù)患者最終因耐藥或者疾病復發(fā)而治療失敗。此外化療往往伴有明顯的副作用如發(fā)生感染、出血以及臟器功能受損等。異基因造血干細胞移植雖然能使部分患者治愈,但移植風險高,部分患者無法找到合適供者,移植并發(fā)癥移植物抗宿主病(GVHD)往往嚴重影響患者生活質(zhì)量。因此尋找高效低毒的藥物對于ALL治療至關重要。細胞周期檢點在調(diào)節(jié)細胞有絲分裂、促進損傷DNA的修復和維護細胞基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中起著重要作用。細胞周期調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生密切相關[1]。Weel屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族,是一種G2/M期檢驗點激酶,調(diào)節(jié)細胞G2/M期轉(zhuǎn)換、組蛋白合成以及DNA損傷的修復[2]。Weel在多種實體腫瘤中高表達,且高表達者預后差[3]。通過RNAi抑制Weel的表達或者藥物抑制其活性,腫瘤細胞從S期或G2期提前進入M期,未完成DNA的合成和修復,表現(xiàn)為細胞組蛋白合成異常,二極紡錘體形成障礙,染色體分散存在,最終退出有絲分裂,引發(fā)細胞凋亡,稱作“有絲分裂障礙”或者“有絲分裂災難”(mitotic catastrophe)"[4]。MK-1775是一種選擇性Weel激酶抑制劑,在乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、髓系白血病等多種腫瘤中表現(xiàn)出抗腫瘤活性[3,5-8]。因此Weel有望成為腫瘤治療的新靶點。然而目前Weel和ALL的關系還未見報道。AKT/mTOR和Notch通路與ALL的關系。在ALL中mTOR通路通常被活化[9]。mTOR的Ser2448位點被AKT磷酸化而活化,活化的mTOR通過磷酸化下游40S核糖體S6蛋白激酶參與調(diào)節(jié)目的基因的翻譯,促進細胞存活、增生、血管生成和化療耐藥。AKT抑制劑MK2206或者mTOR抑制劑雷帕霉素能通過抑制該通路表現(xiàn)出一定的抗白血病效應[10]。Notch是另一條在進化過程中高度保守的信號通路。在哺乳動物中,Notch通路由配體(Jaggedl, Jagged2,DLL1,DLL3和DLL4)、受體(Notch1-4)和靶分子(Hes1、Hes5)組成。Notch分子由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。在活化過程中經(jīng)過3次裂解,其胞內(nèi)段Notch-IC結(jié)合RBPJK(也稱作CSL和CBF-1),活化靶基因Hes轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)下游基因表達從而調(diào)節(jié)細胞的增生和分化。根據(jù)細胞類型和腫瘤環(huán)境的不同,Notch在不同組織中表現(xiàn)出不同的生物活性。研究發(fā)現(xiàn)Notch1的活化突變可以出現(xiàn)在所有亞型的T-ALL中,包括有TAL1,HOX11, HOX11L2, LYL1, MLL-ENL和AF10-CALM基因的T-ALL中。活化的Notch受體通過靶蛋白Hes調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[11]。在T-ALL中,Notch活化促進T-ALL細胞的增生、浸潤和化療耐藥,促進白血病的發(fā)生和進展,是一種促癌基因[12]。在B-ALL中,該通路的作用研究較少,與B-ALL發(fā)生的關系尚需進一步研究。此外,mTOR和Notch信號通路均不是孤立存在的,兩者可發(fā)生相互聯(lián)系。如mTOR可通過上調(diào)Notch1通路影響細胞分化是腫瘤發(fā)生的機制之一[13]。Weel是否與急性淋巴細胞白血病發(fā)病相關,Weel抑制劑能否發(fā)揮抗ALL的效應,機制如何還未見報道。Weel、mTOR、Notch都與細胞增生、存活和腫瘤預后相關,Weel抑制劑是否通過改變PI3K/AKT/mTOR和Notch通路發(fā)揮抗白血病效應還需進一步研究。研究目的：檢測Weel在ALL中的表達水平,研究Weel激酶抑制劑MK-1775對ALL細胞活性、周期調(diào)控、凋亡的影響以及與mTOR和Notch信號通路的關系,初步闡述Weel抑制劑MK-1775抗ALL的機制,為臨床應用提供理論依據(jù)和實驗基礎。研究方法：1.收集初診的成人ALL患者和健康對照者的骨髓標本,淋巴細胞分離液分離骨髓中的單個核細胞,熒光定量RT-PCR檢測Weel mRNA在患者和對照組的表達水平。2.MTT法檢測Weel抑制劑MK-1 775和化療藥物阿霉素對細胞活性的影響：將ALL細胞Nalm-6、Jurkat、Sup-T1、Molt-4和正常骨髓基質(zhì)細胞HS-5接種于96孔培養(yǎng)板中,加入不同濃度的MK-1775、阿霉素或者兩者聯(lián)合培養(yǎng)24、48、72小時,MTT法檢測MK-1775對ALL細胞和HS-5活性的影響,計算細胞活性和半數(shù)抑制濃度(IC50)。3.流式細胞術檢測Weel激酶抑制劑MK-1775對ALL細胞周期的影響：將Nalm-6和Jurkat細胞接種于6孔培養(yǎng)板中,加入OnM、100nM、300nM的MK-1775,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,PI染色,流式細胞術檢測細胞DNA含量,ModFit LT軟件計算細胞周期的變化。4. Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒檢測細胞凋亡：ALL細胞系接種于6孔培養(yǎng)板中,加入不同濃度的MK-1775、阿霉素或者兩者聯(lián)合作用,培養(yǎng)24或48小時,收集細胞,Annexin V-FITC/PI染色,流式細胞術檢測FITC/PI陽性細胞,Summit 5.2軟件計算凋亡率。5. Western blot檢測相關蛋白的表達：ALL細胞系接種于培養(yǎng)瓶中,分別加入一定濃度的MK-1775、阿霉素或者兩者聯(lián)合作用,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,收集細胞,提取蛋白質(zhì),用10%SDS-PAGE膠進行凝膠電泳,Western blot檢測CDK1、p-CDK1、p-H3、PARP1、γH2AX、AKT、mTOR、p-mTOR、bcl-2、Notch1、 Hes1蛋白的表達。研究結(jié)果：1. Weel基因在ALL組和對照組的表達：Weel mRNA在ALL組的表達相對量=2-△Ct(ALL)=0.15±0.08,Well mRNA在對照組的表達相對量=2-△Ct(對照組)=0.09±0.05,ALL組表達高于對照組(p0.05)。2. Weel抑制劑MK-1775體外對細胞活性的影響：(1)MK-1775能抑制ALL細胞的活性,并且呈時間和濃度依賴性。培養(yǎng)48小時,Nalm-6、Molt-4、Jurkat、 Sup-T1細胞的MK-1775的IC50值分別為45.88±3.90 nM、67.60±31.80 nM、 137.39±33.99 nM、347.37±95.47nM。(2)MK-1775抑制HS-5的作用較弱,MK-1775作用48小時,IC50為1472.0±304.8 nM,分別高于四種ALL細胞,均有統(tǒng)計學差異(p0.05)。(3)MK-1775增加ADM的抗ALL活性。加藥培養(yǎng)48小時,Nalm-6細胞單純阿霉素作用組,阿霉素的ICso為0.058±0.017mg/ml,聯(lián)合1OOnMMK-1775治療組,阿霉素的ICso降為0.018±0.012mg/ml, p0.05; Jurkat細胞單純阿霉素作用,阿霉素的IC50為0.044±0.017mg/ml,聯(lián)合100nM MK-1775聯(lián)合作用組,阿霉素的IC50降為和0.003±0.0005mg/ml, p0.05。3. Weel抑制劑MK-1775對細胞周期的影響：Nalm-6和Jurkat細胞培養(yǎng)板中加入0nM、1000nM、300nM的MK-1775,培養(yǎng)24小時,檢測細胞周期。結(jié)果顯示,Nalm-6細胞G1期比例分別為39.2+9.7%、34.8+5.0%(與對照比p0.05)和33.3+5.4%(與對照比p0.05),S期比例分別為55.1±7.7%、60.2±9.6%(與對照比p0.05)、61.4±17.2%(與對照比p0.05),G2/M期比例分別為3.3±2.0%、3.9±3.5%(與對照比p0.05)、7.2±9.0%(與對照比p0.05),與對照比,G1期、S期和G2/M期比值改變統(tǒng)計學無差異；Jurkat細胞G1期比例分別為42.54±4.1%、43.3±7.5%(與對照比p0.05)、15.64±3.5%(與對照比p0.05),S期比例分別為42.6±6.1%和43.34±7.5%(與對照比p0.05)、62.64±9.6%(與對照比p0.05),G2/M期比例分別為12.6±2.7%、14.0±3.4%(與對照比p0.05)和27.0±4.9%(與對照比p0.05),100nM MK-1775治療與對照組相比,各期無明顯變化,300nM治療與空白對照相比,G1期比值下降,S期和G2/M期比值升高,有統(tǒng)計學差異。4. Weel抑制劑MK-1775對細胞凋亡的影響：(1)單藥作用：ALL細胞分別與0nM、100nM、300nM的MK-1775培養(yǎng)48小時,流式細胞術檢測結(jié)果顯示凋亡率分別為3.46±2.25%、64.82±18.44%(與對照比p0.05)、88.83±7.65%(與對照比p0.05)：Jurkat細胞凋亡率分別為2.12±0.47%、41.26±12.30%(與對照比p0.05)、70.08±8.52%(與對照比p0.05)。不同濃度藥物作用凋亡率均高于空白對照,且隨MK-1775濃度升高而增高。 (2)聯(lián)合作用：ALL細胞分別與空白藥物、0.05mg/mlADM、1000nM的MK-1775、0.05mg/mlADM聯(lián)合100nM的MK-1775作用24小時,流式細胞術檢測凋亡。Nalm-6細胞凋亡率分別為2.30±1.13%、12.8±5.07%、17.15±7.89%、49.42±6.82%：Jurkat細胞凋亡率分別為3.01±1.31%、18.50±7.67%、23.25±10.87和67.16±7.67。結(jié)果顯示Nalm-6和Jurkat細胞在兩藥聯(lián)合作用時凋亡率均高于ADM和MK-1775單藥作用以及空白對照組(p0.05)。5.MK-1775對信號蛋白表達的影響：Nalm-6和Jurkat細胞分別與空白藥物、0.05mg/ml ADM、100nM的MK-1775、0.05mg/mlADM聯(lián)合100nM的MK-1775作用24小時,western blot檢測蛋白的表達。結(jié)果提示與空白對照組相比,MK-1775治療組CDK1表達無明顯變化,p-CDK1表達減低,p-H3表達增加,裂解的PARP1增加,γ-H2AX表達增加,Notchl和Hes1表達下降,AKT、mTOR、 p-mTOR、bcl-2蛋白無變化。阿霉素治療組與對照相比,CDK1、p-CDK1、mTOR、 p-mTOR、Notch、Hes1、bcl-2均無明顯變化,p-H3表達減低。兩者聯(lián)合作用,裂解的PARP1和γ-H2AX表達高于單藥和對照組。結(jié)論：1. Weel基因在ALL患者中表達高于對照組,提示W(wǎng)eel在ALL發(fā)病中可能起著重要作用。2. Weel激酶抑制劑MK-1775體外具有抗ALL效應,呈時間和濃度依賴性,隨著時間延長和濃度增高而增強；MK-1775對p53突變型和野生型ALL細胞均有效；MK-1775可增加阿霉素的抗ALL活性。3.與ALL細胞相比,MK-1775抑制骨髓基質(zhì)細胞的作用較弱。4. Weel激酶抑制劑MK-1775通過抑制CDK1磷酸化干預G2/M檢驗點,促進細胞進入M期、抑制DNA修復、增加細胞損傷,誘發(fā)有絲分裂障礙。5. Weel激酶抑制劑MK-1775可能通過下調(diào)Notch1通路誘導細胞凋亡,而不依賴AKT-mTOR信號通路。6. Weel激酶抑制劑MK-1775是一種有應用前景的ALL治療藥物,聯(lián)合治療方案中可減少化療藥物用量,從而降低副作用。
【關鍵詞】：Wee1 MK-1775 急性淋巴細胞白血病 阿霉素 Notch
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-15
• 符號說明15-17
• 前言17-21
• 材料與方法21-33
• 結(jié)果33-43
• 討論43-48
• 結(jié)論48-49
• 附圖49-51
• 參考文獻51-61
• 致謝61-62
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄62-63
• 學位論文評閱及答辯情況表63-64
• 英文論文164-84
• 英文論文284-101
• 英文論文3101-108

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本文編號：258170