發(fā)布時(shí)間：2017-03-20 15:11

  本文關(guān)鍵詞：miR-335-5p在腎癌中的抑癌作用及其分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：腎癌又稱腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)中僅次于膀胱癌,。腎癌對(duì)放療及化療均不敏感,手術(shù)切除仍是目前最佳的治療手段,但術(shù)后復(fù)發(fā)率約為20%-40%。由于腎癌的化療及放療抵抗性,臨床上沒有有效的術(shù)后治療手段。目前的研究仍然對(duì)腎癌的發(fā)生以及進(jìn)展的機(jī)制缺乏足夠深入的理解。探索腎癌的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制,尋找有效的診斷、預(yù)后分子標(biāo)志物及分子治療靶點(diǎn),具有重要的意義。miRNA是一類長度約為20-24個(gè)核苷酸的由內(nèi)源基因編碼的非編碼RNA單鏈分子。越來越多的研究證明這些普遍存在的非編碼小分子在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用。miRNA的表達(dá)水平具有分化的時(shí)序性和位相性。對(duì)于各類疾病,尤其是腫瘤而言,miRNA也出現(xiàn)了時(shí)間和空間上的表達(dá)異常,本研究希望在腎癌中尋找可能的異常表達(dá),并發(fā)現(xiàn)其在基因調(diào)控中所扮演的作用。目的：在收集的腎癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本組織中采用熒光定量PCR的方法檢測miR-335-5p的表達(dá)情況,分析影響miRNA表達(dá)水平的表觀遺傳機(jī)制。以獲得性功能實(shí)驗(yàn)觀察miR-335-5p在腎癌細(xì)胞系786-O, ACHN和Caki-1中的生物學(xué)功能。并且根據(jù)生物信息學(xué)知識(shí),對(duì)潛在的miR-335-5p作用靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,并通過靶點(diǎn)分子的沉默和過表達(dá)實(shí)驗(yàn),證實(shí)miR-335-5p對(duì)靶點(diǎn)的調(diào)控意義,探索可能存在的分子調(diào)控機(jī)制。方法：1.在25對(duì)配對(duì)的腎癌組織標(biāo)本檢測miR-335-5p的相對(duì)表達(dá)量,統(tǒng)計(jì)分析miR-335-5p在腎癌及癌旁腎臟組織中的表達(dá)差異,并分析不同病例級(jí)別與分期的腎癌中miR-335-5p的表達(dá)情況；2.通過體外轉(zhuǎn)染miR-335-5p模擬體(mimic)的方式來進(jìn)行獲得性功能實(shí)驗(yàn)。通過CCK-8、平板克隆形成、Transwell小室法和流式細(xì)胞周期檢測等手段來分析上調(diào)miR-335-5p的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖及遷移侵襲能力帶來的影響；3.結(jié)合在線生物信息學(xué)工具對(duì)miR-335-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測,然后利用Real Time PCR, Western Blot等驗(yàn)證靶基因mRNA以及蛋白表達(dá)量的變化,并利用熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)對(duì)miR-335-5p的靶序列進(jìn)行鑒定,并使用RNA干擾、質(zhì)粒過表達(dá)拯救實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步證實(shí)靶向調(diào)控關(guān)系。結(jié)果：1.在收集的25例腎癌組織標(biāo)本中,有19例為miR-335-5p相對(duì)低表達(dá),占76%。癌組織中]miR-335-5p表達(dá)量平均約為癌旁組織的1/10。2.腎癌細(xì)胞系786-0,ACHN和Caki-1及22例腎癌組織中miR-335-5p啟動(dòng)子區(qū)CpG島較癌旁正常組織呈現(xiàn)高度甲基化狀態(tài),提示DNA甲基化可能與miR-335-5p在腎癌中的低表達(dá)有關(guān)。3.體外轉(zhuǎn)染miR-335-5p mimic至腎癌786-0, ACHN和Caki-1細(xì)胞株從而過表達(dá)miR-335-5p,可以抑制其生長。并且其抑制率呈現(xiàn)時(shí)間與濃度依賴性,在50nMmiR-335-5p mimic處理72小時(shí)后,其抑制率可達(dá)到30-40%(p0.05)。流式細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)50nM miR-335-5p mimic作用48小時(shí)后可以誘導(dǎo)三種腎癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯,而流式細(xì)胞凋亡檢測提示miR-335-5p過表達(dá)并不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-335-5p過表達(dá)可以抑制腎癌細(xì)胞體外克隆形成能力。Transwell小室實(shí)驗(yàn)提示miR-335-5p過表達(dá)不能抑制腎癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。4.成功構(gòu)建裸鼠的皮下荷Caki腫瘤模型。瘤內(nèi)給予脂質(zhì)體包裹的miR-335-5p,觀察到移植瘤的生長受到明顯抑制,同時(shí)檢測到瘤組織中增殖相關(guān)蛋白Ki67和p-Rb表達(dá)下調(diào)。5.通過在線軟件的分析,將序列比對(duì)程序分析結(jié)果與細(xì)胞表型變化相結(jié)合,預(yù)測CDK2、CCNE2可能是miR-335-5p的靶基因,同時(shí)通過Real-time RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測到CDK2和CCNE2在過表達(dá)miR-335-5p后mRNA水平和蛋白水平都有下調(diào)。進(jìn)一步熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析證實(shí)CDK2和CCNE2是miR-335-5p的直接作用靶點(diǎn),其3'-UTR中存在miR-335-5p調(diào)控的作用序列。6.miR-335-5p對(duì)腎癌細(xì)胞的抑制增殖作用部分通過AKT/FOXO1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。結(jié)論：1.與癌旁對(duì)照組織相比,腎癌組織中miR-335-5p相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)。但是本研究未能提示miR-335-5p表達(dá)量高低與腎癌的惡性程度相關(guān)。2.體外轉(zhuǎn)染miR-335-5p mimic使其過表達(dá)使得腎癌細(xì)胞株發(fā)生細(xì)胞周期阻滯及增殖抑制。同時(shí),miR-335-5p的過表達(dá)還削弱了腎癌細(xì)胞的克隆形成能力。3.CDK2和CCNE2是miR-335-5p的直接作用靶點(diǎn),還可以通過/AKT/FOXO1信號(hào)通路發(fā)揮抑制增殖作用。
【關(guān)鍵詞】：腎癌 微小RNA 增殖 G1期阻滯 CDK2 CCNE2
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.11
【目錄】：

• 致謝6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-12
• 英文縮寫一覽表12-15
• 引言15-20
• 參考文獻(xiàn)17-20
• 1. miR-335-5P在人腎癌中的表達(dá)情況及調(diào)控機(jī)制20-47
• 1.1 前言20-22
• 1.2 材料與方法22-33
• 1.3 結(jié)果33-40
• 1.4 討論40-42
• 1.5 結(jié)論42-43
• 1.6 參考文獻(xiàn)43-47
• 2. miR-335-5P對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響47-70
• 2.1 前言47-49
• 2.2 材料和方法49-56
• 2.3 結(jié)果56-64
• 2.4 討論64-66
• 2.5 結(jié)論66-67
• 2.6 參考文獻(xiàn)67-70
• 3. miR-335-5P的靶基因及影響腎癌的分子機(jī)制探討70-100
• 3.1 前言70-72
• 3.2 材料與方法72-86
• 3.3 結(jié)果86-93
• 3.4 討論93-96
• 3.5 結(jié)論96-97
• 3.6 參考文獻(xiàn)97-100
• 小結(jié)與展望100-101
• 綜述101-111
• 參考文獻(xiàn)107-111
• 作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果111-112
• 已發(fā)表文章112-122

【共引文獻(xiàn)】

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9 龐迎新;miRNA-519d、雙聯(lián)芐化合物DHA2對(duì)卵巢癌的生長抑制作用及其機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2014年

10 孫權(quán)權(quán);miR-200c靶向UBQLN1調(diào)節(jié)自噬及乳腺癌的輻射抵抗[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：miR-335-5p在腎癌中的抑癌作用及其分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：257995