本文關(guān)鍵詞：線粒體途徑參與蟾毒靈誘導肺癌細胞凋亡的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的：本課題基于中醫(yī)學“以毒攻毒”理論,旨在研究蟾皮有效單體蟾毒靈在體外條件下對肺癌細胞增殖和凋亡的影響,并探討線粒體膜電位及線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白在其中的作用,以初步探討蟾毒靈抗肺癌的有效分子機制。在抗癌新藥飛速發(fā)展的今天,為新型天然來源的抗腫瘤中藥的進一步研發(fā)和以毒攻毒治法的臨床運用提供必要的理論和實驗依據(jù)。研究方法：1.采用CCK-8法檢測蟾毒靈對人非小細胞肺癌A549細胞體外增殖的抑制效應(yīng),篩選出有效作用劑量范圍,并判定量效關(guān)系。2. Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細胞儀檢測低、中、高濃度組蟾毒靈作用48h下對人非小細胞肺癌A549細胞凋亡的影響；流式細胞儀分析4ng/mL蟾毒靈作用下對肺癌A549細胞周期的影響。3.倒置顯微鏡觀察各濃度組蟾毒靈作用于肺癌A549細胞48h后對細胞形態(tài)學的影響；并以透射電鏡觀察4ng/mL蟾毒靈作用后A549細胞超微結(jié)構(gòu)的改變及凋亡現(xiàn)象的產(chǎn)生。4.運用JC-1染色探針在熒光顯微鏡下觀察4ng/mL蟾毒靈作用下A549細胞線粒體膜電位的變化情況。5. Western Blot法檢測低、中、高濃度組蟾毒靈作用下肺癌A549細胞中與線粒體途徑凋亡相關(guān)的細胞色素C、Caspase-3蛋白的表達情況；以及加入Caspase抑制劑后各組蛋白表達強度的變化,以探討線粒體途徑參與蟾毒靈誘導肺癌細胞凋亡的分子機制。研究結(jié)果：1.不同濃度的蟾毒靈均對肺癌A549細胞表現(xiàn)出明顯的生長抑制作用,與對照組比較,具有明顯的統(tǒng)計學差異(P0.01),且給藥濃度與抑制效用之間存在良好的依賴性,量效曲線明顯。且4ng/mL濃度的蟾毒靈組與順鉑(4pμg/mL)組比較,其OD值未見明顯差異(P0.05),表明體外環(huán)境下中藥單體蟾毒靈的抗癌活性強,量效性優(yōu)勢明顯；同時擬定后續(xù)實驗中蟾毒靈的最佳作用濃度為4ng/mL2.人肺腺癌A549細胞經(jīng)過不同濃度的蟾毒靈處理48h后,與正常組相比,各劑量組均導致不同程度的細胞凋亡,差異明顯(P0.05),且總凋亡率及早期凋亡率均呈現(xiàn)出隨劑量增高而逐漸增長的趨勢；其中,各劑量組組間早期凋亡率相比較,除4ng/mL與8ng/mL比較無統(tǒng)計學意義外(P0.05),其余均差異明顯(P0.05),表明肺癌細胞凋亡程度與蟾毒靈劑量呈一定比例正相關(guān)性,其量效關(guān)系良好。同時,當蟾毒靈以4ng/mL濃度作用于肺癌A549細胞48h后,細胞增殖周期中各期所占比例均有不同程度的變化；其中,與正常組比較,僅見兩者的S期比例存在顯著性差異(P0.01),表明經(jīng)蟾毒靈作用后S期比例下降明顯,而G1、G2/M期未見明顯變化。實驗結(jié)果提示S期阻滯可能是蟾毒靈抑制肺癌細胞生長的機制之一3.倒置顯微鏡觀察正常對照組A549細胞呈飽滿梭性貼壁生長,細胞輪廓清晰、排列緊密,生長狀況良好；而各濃度蟾毒靈組均可見細胞數(shù)目不同程度的減少,隨著給藥濃度的增加,A549細胞形態(tài)逐漸皺縮變圓并脫壁、細胞密度逐漸減少、細胞間隙逐漸增大、胞漿顆粒逐漸增多,甚至可見較多細胞碎片。上述現(xiàn)象表明經(jīng)蟾毒靈處理后,肺癌A549細胞生長受到明顯的抑制。4ng/mL蟾毒靈作用于人肺癌A549細胞48h后透射電鏡下可見細胞體積明顯皺縮,細胞表面絨毛較少,核仁消失,染色質(zhì)固縮凝集,并沿核膜形成數(shù)個團塊狀邊集；細胞器如線粒體數(shù)量減少、線粒體膜腫脹、線粒體嵴破壞；尚未形成明顯的凋亡小體。而正常對照組細胞膜表面光滑完整,可見微絨毛,胞質(zhì)密度均勻,無空泡,核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻,核仁完整,居中或邊移；細胞器超微結(jié)構(gòu)較清晰、完整。4.熒光顯微鏡觀察染色后細胞,并分別拍攝紅色和綠色通道,對照組和實驗組均采用相同曝光強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組的綠色熒光強度相當,而紅色熒光較對照組相對偏弱。與對照組相比,實驗組紅/綠熒光強度比值下降明顯(P0.05),提示線粒體膜電位去極化程度增加。實驗結(jié)果表明線粒體膜電位在蟾毒靈誘導肺癌A549細胞凋亡的過程中起著重要的作用。5.經(jīng)蟾毒靈作用48h后,與對照組相比,肺癌A549細胞中胞漿Cyt C蛋白表達量隨給藥濃度增加而逐漸上調(diào),而Cyt C蛋白總表達量未見明顯變化,由此表明蟾毒靈的促凋亡作用可能與細胞色素C向胞漿內(nèi)釋放的過程密切相關(guān)。隨著給藥濃度的增加,蟾毒靈各組的活化Caspase-3蛋白表達量亦逐漸增強,而蟾毒靈聯(lián)合Caspase抑制劑的對照組并未引出活化Caspase-3蛋白。因此,可以說明在蟾毒靈的促凋亡機制中,Caspase-3活化是其必不可少的步驟。上述實驗可進一步證實,通過誘導線粒體膜內(nèi)的細胞色素C向胞漿內(nèi)釋放,從而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng),最終活化Caspase-3,即線粒體凋亡途徑,是蟾毒靈發(fā)揮凋亡作用的有效機制之一。研究結(jié)論：1.蟾毒靈在體外環(huán)境可顯著抑制肺癌A549細胞生長,呈明顯的劑量依賴性；其機制可能與誘導細胞凋亡及干擾周期有關(guān)；2.蟾毒靈可通過誘導肺癌A549細胞早期凋亡抑制細胞增殖,細胞呈現(xiàn)出典型的凋亡早期形態(tài)學改變,該效應(yīng)與劑量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)性；同時,干擾肺癌A549細胞S期合成可能是其作用機制之一；3.蟾毒靈誘導肺癌細胞凋亡的過程呈線粒體依賴性,通過降低線粒體膜電位、影響線粒體功能從而促發(fā)早期凋亡；4.線粒體途徑的激活是蟾毒靈發(fā)揮促凋亡作用的方式之一,分子層面可見該途徑相關(guān)蛋白如細胞色素C在蟾毒靈作用下向胞漿釋放,并順次啟動Caspase家族激活,并由Caspase-3最終執(zhí)行凋亡。
【關(guān)鍵詞】：蟾毒靈 以毒攻毒 肺癌 線粒體途徑 細胞色素C Caspase-3
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R273
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 第一部分 理論研究16-34
• 一、肺癌的中西醫(yī)研究現(xiàn)狀16-26
• (一) 中醫(yī)從“毒”論治肺癌16-23
• 1. 歷史溯源16
• 2. 從“毒”識癌16-19
• 3. 以“毒”治癌19-21
• 4. 章永紅教授臨證以毒攻毒治癌經(jīng)驗21-23
• (二) 現(xiàn)代醫(yī)學的肺癌研究概況23-26
• 1. 組織分型與常規(guī)治療23-24
• 2. 分子分型與靶向治療24-26
• 二、線粒體途徑參與細胞凋亡的研究26-30
• 1. 凋亡狀態(tài)下線粒體的變化26-29
• 2. 作用于線粒體途徑的抗腫瘤中藥研究29-30
• 三、蟾毒靈抗腫瘤作用的機制研究30-34
• 1. 抑制腫瘤增殖30
• 2. 調(diào)控細胞周期30
• 3. 誘導腫瘤細胞分化30-31
• 4. 促進腫瘤細胞凋亡31-33
• 5. 拮抗腫瘤血管生成33
• 6. 逆轉(zhuǎn)多藥耐藥33-34
• 第二部分 實驗研究34-66
• 實驗一 CCK-8法檢測蟾毒靈體外抑制肺癌A549細胞增殖的作用35-41
• 1. 實驗材料35-36
• 2. 實驗方法36-37
• 3. 實驗結(jié)果37-39
• 4. 討論39-41
• 實驗二 流式細胞儀檢測蟾毒靈誘導肺癌A549細胞凋亡的作用及對其增殖周期的影響41-48
• 1. 實驗材料41-42
• 2. 實驗方法42-44
• 3. 實驗結(jié)果44-46
• 4. 討論46-48
• 實驗三 蟾毒靈對肺癌A549細胞形態(tài)學及線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響48-54
• 1. 實驗材料48-49
• 2. 實驗方法49-50
• 3. 實驗結(jié)果50-52
• 4. 討論52-54
• 實驗四 蟾毒靈對肺癌A549細胞線粒體膜電位的影響54-59
• 1. 實驗材料54-55
• 2. 實驗方法55-56
• 3. 實驗結(jié)果56-57
• 4. 討論57-59
• 實驗五 Western Blot檢測蟾毒靈對肺癌A549細胞Cyt C、Caspase-3蛋白表達的影響59-66
• 1. 實驗材料59-60
• 2. 實驗方法60-63
• 3. 實驗結(jié)果63-64
• 4. 討論64-66
• 第三部分 結(jié)語66-68
• 一、結(jié)論66
• 二、創(chuàng)新點66
• 三、不足及展望66-68
• 參考文獻68-75
• 附錄75-82
• 攻讀博士學位期間取得的學術(shù)成果82-83
• 致謝83-84
• 作者簡介84

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王笑民;張青;;基于“癌毒”的腫瘤發(fā)生發(fā)展規(guī)律探討[J];中華中醫(yī)藥雜志;2011年07期

2 金姝,葛海良;線粒體異常與腫瘤的關(guān)系[J];國外醫(yī)學(腫瘤學分冊);2005年11期

3 熊建文;肖化;張鎮(zhèn)西;;MTT法和CCK-8法檢測細胞活性之測試條件比較[J];激光生物學報;2007年05期

4 王婧;蔣燕;李鶇;;中醫(yī)“以毒攻毒法”在惡性腫瘤治療中的運用[J];北京中醫(yī)藥大學學報;2011年08期

5 王南瑤;李蘇宜;趙偉;秦叔逵;劉琳;陳慧英;;華蟾素聯(lián)合三氧化二砷抑制雞胚尿囊膜血管生成的實驗研究[J];臨床腫瘤學雜志;2006年07期

6 王謙;宋勇;;肺癌內(nèi)科治療研究新進展[J];臨床腫瘤學雜志;2008年08期

7 鄒翔;曲中原;高鵬;季宇彬;;萊菔硫烷對人肝癌HepG-2細胞Bcl-2與Bax基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達的影響[J];上海中醫(yī)藥大學學報;2010年02期

8 張寧;凌昌全;;蟾毒靈誘導腫瘤細胞凋亡機制的研究進展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2009年01期

9 李瑞娜;郝元濤;;肺癌流行病學和病因?qū)W研究[J];實用醫(yī)學雜志;2009年11期

10 彭遠英,彭正松,喻可芳;凋亡細胞的超微結(jié)構(gòu)變化[J];細胞生物學雜志;2003年05期

  本文關(guān)鍵詞：線粒體途徑參與蟾毒靈誘導肺癌細胞凋亡的機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：257809