發(fā)布時(shí)間：2017-03-20 04:04

  本文關(guān)鍵詞：氯離子通道阻斷劑對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及分子機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),心力衰竭、病毒性心肌炎、心肌衰老等疾病均伴有廣泛的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生。近年來研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞膜內(nèi)外離子通道的調(diào)控與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),在心肌細(xì)胞凋亡模型的研究中,應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)直接記錄到類似于容積敏感性外向整流Cl-電流(volumesensitive outwardly rectifying chloride channel,VSOR),結(jié)合相關(guān)的生化指標(biāo),證明了阻斷VSOR氯通道能有效的減輕心肌細(xì)胞損傷。目前已有VSOR氯離子通道與死亡受體(TNFR或Fas)或經(jīng)線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究報(bào)道。然而,有關(guān)VSOR氯離子通道與細(xì)胞凋亡的機(jī)制并未闡明。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)生成和鈣離子貯存的主要場所。內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)以及高效運(yùn)轉(zhuǎn),對于維持細(xì)胞的正常功能和存活非常重要。細(xì)胞內(nèi)大約1/3功能蛋白的合成、正確折疊及結(jié)構(gòu)成熟在ER內(nèi)發(fā)生,在合成、折疊的同時(shí)伴隨大量細(xì)胞膜內(nèi)外離子通道的開放或關(guān)閉,其中最重要的陰離子通道氯離子通道和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞漿內(nèi)鈣池中Ca2+離子內(nèi)外交換,掌控著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的物質(zhì)交換平衡,維持胞質(zhì)內(nèi)自穩(wěn)態(tài)。一旦細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞,例如缺乏分子伴侶或細(xì)胞能量,Ca2+缺乏,氧化還原環(huán)境破壞,蛋白質(zhì)變異和二硫鍵減少,導(dǎo)致蛋白質(zhì)無法正確折疊。真核生物細(xì)胞通過一系列適應(yīng)途徑對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂作出快速反應(yīng),稱之為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)對于細(xì)胞存活具有雙重作用。早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激跨膜感受性蛋白PERK、ATF6和IRE1α受體蛋白解離,繼而激活三個(gè)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)的效應(yīng)器,發(fā)揮UPR的促細(xì)胞存活功能;過度的ERS經(jīng)獨(dú)立的信號途徑致細(xì)胞發(fā)生凋亡。近年來,大量的研究證實(shí)ERS參與了多種心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展,成為心血管疾病研究的新熱點(diǎn)。那么,ERS作為新的凋亡途徑,它是否也與VSOR氯離子通道共同參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生呢?如果參與,二者在細(xì)胞凋亡過程中是否有相互調(diào)控作用?具體機(jī)制如何呢?目前國內(nèi)外尚未有報(bào)道。本研究基于我們前期發(fā)現(xiàn)VSOR氯通道參與了心肌細(xì)胞凋亡的過程,阻斷VSOR氯通道能有效的挽救心肌細(xì)胞凋亡性死亡的基礎(chǔ)上,擬應(yīng)用衣霉素(tunicamycin,Tm)在體內(nèi)和體外兩個(gè)水平構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠動物心力衰竭模型和心肌細(xì)胞凋亡模型,并進(jìn)一步探討:①氯離子通道是否參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡?在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平持續(xù)加重時(shí),阻斷VSOR氯離子通道能否有效挽救細(xì)胞凋亡的發(fā)生?②VSOR氯離子通道與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相互之間如何調(diào)控?其分子機(jī)制?為治療心血管凋亡相關(guān)性疾病提供全新的依據(jù)和策略。研究目的:1.構(gòu)建衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致小鼠心力衰竭與心肌細(xì)胞凋亡模型,探討衣霉素造模最佳的量效、時(shí)效條件;2.探討VSOR氯通道功能變化對衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響;3.探討在ERS過程中VSOR氯通道對心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號通路調(diào)控與分子機(jī)制。研究方法:1.實(shí)驗(yàn)動物及工具藥物:應(yīng)用8周齡C57 BL/6雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)對象。應(yīng)用衣霉素構(gòu)建經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型;氯離子通道包括非特異阻斷劑DIDS和VSOR氯離子通道特異性阻斷劑DCPIB。2.實(shí)驗(yàn)分組:①原代心肌細(xì)胞模型分組:正常對照組、Tm組(100ng/ml)、Tm(100ng/ml)+DIDS(75 μM)組、DIDS(75 μM)組、Tm(100ng/ml)+DCPIB(2 μM)組、DCPIB(2 μM)組;②在體小鼠模型分組:假手術(shù)(Sham)組、Tm組、Tm+DIDS組、DIDS組、Tm+DCPIB、DCPIB 組。3.小鼠心力衰竭模型構(gòu)建:衣霉素小劑量腹腔內(nèi)注射,Tm濃度為3 mg/kg,DIDS濃度為14 mg/kg,DCPIB注射濃度為5 mg/kg,造模48小時(shí)后檢測心肌細(xì)胞凋亡及小鼠心臟心功能變化。4.采用MTT法檢測Tm對心肌細(xì)胞存活率的影響。5.應(yīng)用TUNEL法、流式細(xì)胞儀及激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察心肌細(xì)胞凋亡情況。6.應(yīng)用免疫印跡法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78和CHOP表達(dá);ERS信號通路相關(guān)蛋白ATF4、p-e IF2α、e IF2α表達(dá)水平,下游信號cleaved caspase-12、p-JNK、JNK、Bcl-2、Bax、Bax線粒體轉(zhuǎn)位水平以及TRB3、p-Akt、Akt的表達(dá)水平。7.應(yīng)用caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3活性。8.MQAE檢測Tm對心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的影響。9.免疫熒光法檢測心肌細(xì)胞GRP78/CHOP表達(dá)水平。10.實(shí)時(shí)定量PCR檢測XBP 1S m RNA水平。11.應(yīng)用CHOP基因沉默技術(shù)對H9C2細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染,檢測H9C2細(xì)胞總蛋白、胞漿、胞核β-catenin蛋白表達(dá)水平。采用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測β-catenin活性。研究結(jié)果:1.構(gòu)建了理想的Tm誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型。衣霉素對心肌細(xì)胞存活率呈劑量及時(shí)間依賴性降低,流式結(jié)果顯示Tm處理72 h細(xì)胞凋亡率最明顯,達(dá)到32.4±4.1%(P0.05,n=12),Tm100 ng/ml、作用72 h為造模最佳實(shí)驗(yàn)條件。衣霉素處理心肌細(xì)胞后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78、CHOP的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加,24 h GRP78、CHOP m RNA表達(dá)至峰值,提示衣霉素是通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。2.小鼠腹腔內(nèi)注射衣霉素,48 h后小鼠心臟收縮功能顯著降低。與假手術(shù)組Sham相比,衣霉素組左室射血分?jǐn)?shù)由66.5±3.6%降至32.7±1.3%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5)。構(gòu)建了理想的衣霉素誘導(dǎo)心臟心力衰竭模型。3.心肌細(xì)胞存活率在衣霉素組、DIDS和DCPIB組分別是57.4±3.18%、80.4±1.2%和78.4±0.8%;心肌細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性在衣霉素組、DIDS和DCPIB組分別是88.4±3.4%、45.6±1.2%和42.1±2.6%;與衣霉素組相比,DIDS和DCPIB組在細(xì)胞存活率及caspase-3活性組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5),提示DIDS和DCPIB組能夠顯著抑制caspase-3活性及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。4.反映細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的MQAE熒光強(qiáng)度在正常對照組、衣霉素組及DIDS組分別是0.9±0.18、11.3±0.7和3.6±0.4;與正常對照組相比,衣霉素組MQAE熒光強(qiáng)度顯著升高,兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5);與衣霉素組相比,DIDS組MQAE熒光強(qiáng)度顯著下降,二組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5)。結(jié)果提示MQAE熒光強(qiáng)度能夠反映細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度水平,其強(qiáng)度與氯離子濃度呈負(fù)相關(guān),DIDS能夠顯著抑制氯離子外流。5.信號分子ATF4、CHOP和p-e IF2α/e IF2α在正常對照組、衣霉素組、DIDS組和DCPIB組中的表達(dá)分別約是1、2.5、1.5和1.25倍,與正常對照組相比,衣霉素組中各指標(biāo)顯著增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,n=5);而與衣霉素組相比,DIDS和DCPIB組上述指標(biāo)顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,n=5);提示DIDS和DCPIB組能夠顯著抑制ATF4、CHOP和p-e IF2α/e IF2α蛋白表達(dá)(P0.05,n=5)。6.信號分子p-JNK、JNK通路蛋白在正常對照組、衣霉素組、DIDS組中表達(dá),各組間相比,均無顯著性差異(P0.05,n=5),表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白JNK的活化不受DIDS的影響。7.XBP 1S m RNA轉(zhuǎn)錄水平在正常對照組、衣霉素組、DIDS組和DCPIB組中分別為1、0.5、0.85和0.88倍;與正常對照組相比,衣霉素組XBP 1S m RNA顯著下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,n=5);而與衣霉素組相比,DIDS和DCPIB組XBP1S m RNA顯著增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,n=5);提示DIDS和DCPIB能夠顯著增加心肌細(xì)胞內(nèi)XBP 1S m RNA轉(zhuǎn)錄水平。8.凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax蛋白比值在正常對照組,衣霉素組、DIDS組中分別是1、0.6,1.25倍,與正常對照組相比,衣霉素組Bcl-2/Bax蛋白比值明顯下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,n=5);而與衣霉素組相比,DIDS組Bcl-2/Bax蛋白比值上升,二者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5)。與衣霉素組相比,DIDS組cleaved caspase-12蛋白表達(dá)下降近1倍,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5)。提示DIDS能夠顯著增加心肌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)水平,并可以減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促凋亡蛋白cleaved caspase-12表達(dá)。9.Wnt相關(guān)蛋白β-catenin在正常情況下細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)一定表達(dá)水平而發(fā)揮功能,而衣霉素處理24 h后,細(xì)胞核內(nèi)β-catenin水平顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5),提示衣霉素導(dǎo)致β-catenin核轉(zhuǎn)位明顯減少;si CHOP時(shí)Topflash熒光讀數(shù)是陰性組及正常對照組的3倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5)。提示干涉CHOP基因時(shí)β-catenin活性顯著升高,表明CHOP對Wnt蛋白具有調(diào)控作用。10.Topflash熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)觀察β-catenin活性水平,熒光讀數(shù)在對照組、衣霉素組、si CHOP、DIDS和DCPIB分別是1、0.5、0.8,0.9和0.85。與正常對照組相比,衣霉素組β-catenin活性顯著降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5);而與衣霉素組相比,si CHOP、DIDS、DCPIB組β-catenin活性顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5),提示DIDS和DCPIB能夠抑制衣霉素誘導(dǎo)的Wnt活性下調(diào)。11.通過si CHOP轉(zhuǎn)染預(yù)處理并衣霉素干預(yù),分別檢測β-catenin活性在陰性對照組、衣霉素組、DIDS組和DCPIB組的變化,結(jié)果顯示DIDS或DCPIB處理后,對衣霉素誘導(dǎo)的β-catenin活性降低無明顯改善(P0.05,n=5),從另一方面提示阻斷CHOP后,DIDS或DCPIB喪失了對β-catenin活性的調(diào)控作用,進(jìn)一步反映Wnt是CHOP下游分子。特別是使用Wnt信號通路抑制劑s FRP后,DIDS或DCPIB同樣失去了對β-catenin活性的調(diào)節(jié),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5)。提示沉默CHOP信號通路后或Wnt信號通路直接阻斷后,氯離子通道阻斷劑不能調(diào)控β-catenin活性的表達(dá)。12.心肌細(xì)胞存活率在衣霉素組、si CHOP、DIDS和DCPIB組分別是56.8±7.23%、74.4±5.2%、76.6±3.1%和77.8±5.8%;與衣霉素組相比,si CHOP、DIDS和DCPIB組在細(xì)胞存活率顯著增加,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=12)。而s FRP抑制Wnt通路后,導(dǎo)致si CHOP、DIDS或DCPIB喪失了細(xì)胞保護(hù)作用。提示si CHOP、DIDS和DCPIB組能夠顯著抑制衣霉素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡,其保護(hù)作用可被s FRP阻斷,說明Wnt信號通路是CHOP下游的調(diào)控分子。結(jié)論:1.衣霉素可通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生,進(jìn)一步在小鼠體內(nèi)證實(shí)衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可明顯損傷心肌收縮功能;氯通道阻斷劑DIDS、DCPIB能夠有效地減輕衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性心肌細(xì)胞凋亡及改善在體心臟受損的心功能。2.衣霉素是通過調(diào)控p-e IF2α/ATF4和XBP1蛋白通路,增加了促凋亡基因CHOP的生成而非JNK通路誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。DIDS、DCPIB能夠通過抑制該途徑減少了促凋亡基因CHOP的生成;同時(shí)DIDS也能夠顯著增加心肌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)水平,并可以減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促凋亡蛋白caspase-12表達(dá),達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。3.CHOP信號通路對Wnt信號通路有明顯的調(diào)控作用,Wnt通路是其下游分子,DIDS或DCPIB組能夠顯著抑制衣霉素對Wnt相關(guān)蛋白β-catenin的下調(diào)作用,該作用可被s FRP所阻斷。氯離子通道阻斷劑發(fā)揮抗凋亡的保護(hù)效應(yīng)是通過CHOP/Wnt信號通路介導(dǎo)的。
【關(guān)鍵詞】：容積敏感性氯離子通道 Tunicamycin 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 心肌細(xì)胞 凋亡 CHOP Wnt
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-21
• 前言21-23
• 文獻(xiàn)回顧23-41
• 第一部分 構(gòu)建衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致心肌細(xì)胞凋亡模型及心臟功能衰竭模型41-55
• 1 材料41-43
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物41
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑41-42
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器42-43
• 2 方法43-48
• 2.1 原代乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)43-44
• 2.2 實(shí)驗(yàn)分組44
• 2.3 MTT法檢測心肌細(xì)胞存活率44
• 2.4 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率44
• 2.5 乳酸脫氫酶釋放檢測44-45
• 2.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測心肌細(xì)胞GRP78、CHOP m RNA水平45-46
• 2.7 構(gòu)建小鼠心衰模型46
• 2.8 2D M-mode超聲心動圖診斷46-47
• 2.9 小鼠心臟標(biāo)本取材處理冰凍切片制備47
• 2.10 小鼠心臟心肌細(xì)胞凋亡檢測47-48
• 2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理48
• 3 結(jié)果48-53
• 3.1 衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對心肌細(xì)胞存活率的影響48-49
• 3.2 衣霉素對心肌細(xì)胞凋亡的影響49-50
• 3.3 PCR檢測衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78和CHOP表達(dá)50-51
• 3.4 動物模型建立后的一般特征51
• 3.5 衣霉素對在體小鼠心臟功能的影響51
• 3.6 衣霉素對在體小鼠心臟組織損傷及凋亡水平的影響51-53
• 4 討論53-55
• 第二部分DIDS和DCPIB對衣霉素誘導(dǎo)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的影響55-67
• 1 材料55-56
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物55
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑55
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器55-56
• 256-60
• 2.1 原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)56
• 2.2 實(shí)驗(yàn)分組56-57
• 2.3 MTT法檢測氯離子通道阻斷劑對心肌細(xì)胞存活率的影響57
• 2.4 TUNEL染色法檢測心肌細(xì)胞凋亡率57
• 2.5 Caspase-3 活性檢測57-58
• 2.6 氯離子熒光探針（MQAE）檢測細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度58
• 2.7 心肌細(xì)胞表面GRP78熒光水平檢測58-59
• 2.8 免疫印跡法檢測cleaved caspase-3 表達(dá)59-60
• 2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理60
• 3 結(jié)果60-65
• 3.1 MTT法檢測氯離子通道阻斷劑對衣霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率的影響60-62
• 3.2 TUNEL法檢測DIDS、DCPIB對衣霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率的影響62-63
• 3.3 DIDS對衣霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞cleaved caspase-3 表達(dá)的影響63
• 3.4 DIDS、DCPIB對衣霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞caspase-3 活性的影響63-64
• 3.5 衣霉素對心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的影響64
• 3.6 氯離子通道阻斷劑對衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶表達(dá)的影響64-65
• 4 討論65-67
• 第三部分DIDS、DCPIB對衣霉素誘導(dǎo)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路的調(diào)控67-78
• 1 材料67-69
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物67
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑67-68
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器68-69
• 2 方法69-71
• 2.1 原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)69
• 2.2 實(shí)驗(yàn)分組69
• 2.3 免疫印跡法檢測cleaved caspase-12、CHOP、ATF4、pe IF2α、e IF2α、JNK表達(dá) · 642.4 心肌細(xì)胞表面CHOP熒光水平檢測69-70
• 2.4 心肌細(xì)胞表面 CHOP 熒光水平檢測70
• 2.5 實(shí)時(shí)定量PCR監(jiān)測XBP 1S m RNA水平。70
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理70-71
• 3 結(jié)果71-76
• 3.1 氯通道阻斷劑對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白CHOP的影響71
• 3.2 氯通道阻斷劑對Tm誘導(dǎo)的ERS信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響71-75
• 3.3 氯離子通道阻斷劑DIDS對Tm誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡分子的影響75-76
• 3.4 DIDS 對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 CHOP 信號通路下游信號分子的影響76
• 4 討論76-78
• 第四部分DIDS、DCPIB對衣霉素誘導(dǎo)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與Wnt通路的調(diào)控機(jī)制78-90
• 1 材料78-79
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物78
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑78-79
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器79
• 1.4 試劑配制79
• 2 方法79-81
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)79
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方案79-80
• 2.3 Western blotting法檢測H9C2細(xì)胞胞漿、胞核 β-catenin蛋白表達(dá)水平80
• 2.4 H9C2細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測80-81
• 2.5 CHOP基因沉默81
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析81
• 3 結(jié)果81-87
• 3.1 衣霉素對H9C2心肌細(xì)胞系Wnt通路相關(guān)蛋白 β-catenin活性的影響81-82
• 3.2 DIDS、DCPIB對衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中Wnt通路的影響82-84
• 3.3 DIDS、DCPIB對衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中CHOP與Wnt通路調(diào)控的機(jī)制84-85
• 3.4 si CHOP干涉后對細(xì)胞存活率的影響85-87
• 4 討論87-90
• 小結(jié)90-91
• 參考文獻(xiàn)91-100
• 個(gè)人簡歷和研究成果100-102
• 致謝102

  本文關(guān)鍵詞：氯離子通道阻斷劑對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：257101