本文關鍵詞：Rab5 GTPase介導的VE-cadherin內(nèi)吞調控肺微血管內(nèi)皮細胞屏障功能的機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:血管內(nèi)皮細胞襯于血管壁內(nèi)側形成半選擇性的通透屏障,可以調節(jié)血漿蛋白、溶質、液體及炎癥細胞的轉運。內(nèi)皮完整性是維持內(nèi)皮屏障功能的基礎。內(nèi)皮屏障的破壞及內(nèi)皮通透性的增加是許多急慢性炎癥性疾病發(fā)病機制中必不可少的組成部分,其中包括急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)、動脈粥樣硬化、腫瘤等。細胞間連接包括粘附連接、緊密連接、橋粒和縫隙連接。其中內(nèi)皮細胞主要表達粘附連接和緊密連接,它們在維持內(nèi)皮細胞完整性及內(nèi)皮細胞正常生物學功能中發(fā)揮重要作用。細胞間粘附連接參與調控多種細胞功能,包括建立和維持細胞間粘附、細胞骨架重構、細胞內(nèi)信號傳導及轉錄后調控等。緊密連接主要參與調控內(nèi)皮通透性。研究表明粘附連接的組裝和構建先于緊密連接,并且作為內(nèi)皮特異性的粘附連接—血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)在維持血管完整性上起重要作用,包括骨架重排、細胞極性的建立及緊密連接的重構等。研究表明Rab蛋白是一類小分子GTP結合蛋白,在囊泡運輸?shù)霓D運、粘附、錨定和融合等不同階段均發(fā)揮著重要的調控作用。Rab蛋白通過介導囊泡運輸,調節(jié)多種細胞表面受體分子的表達和功能。其中,Rab5作為早期內(nèi)涵體的標記物,可介導胞膜蛋白至內(nèi)涵體的囊泡運輸。既往研究表明Rab5不僅可以調節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCR)的轉運,還參與調控細胞間連接蛋白的定位,并且Rab5可通過影響受體酪氨酸激酶的活性來調節(jié)邊緣細胞遷移和極性。另外,Rab5及其效應因子在維持平面細胞極性(planar cell polarity,PCP)中也發(fā)揮重要作用。然而,作為粘附連接的重要組分—VE-cadherin,能否被Rab5調控及Rab5如何調控其內(nèi)吞,繼而調控內(nèi)皮細胞極性及屏障功能目前尚不明確。本研究中我們應用人肺微血管內(nèi)皮細胞(human lung microvascular endothelial cells,HPMECs)通過抑制或過表達其中Rab5的表達,觀察脂多糖(LPS)對內(nèi)皮細胞中VE-cadherin內(nèi)吞、骨架重構及細胞極性的影響,并且應用體內(nèi)外實驗研究Rab5對內(nèi)皮屏障功能的調節(jié)作用。初步探討了Rab5調節(jié)內(nèi)皮屏障功能的機制。實驗結果有望為內(nèi)皮屏障功能障礙和血管炎癥的防治提供新的思路和有價值的潛在靶標。研究目的:1.明確lps對hpmecs中rab5表達及活性的影響。2.探討rab5對hpmecs中ve-cadherin內(nèi)吞及細胞極性的調節(jié)作用。3.體內(nèi)外研究探討rab5調節(jié)內(nèi)皮屏障功能的機制。研究方法:1.培養(yǎng)hpmecs,應用westernblot(wb)檢測lps處理后不同時間點hpmecs中rab5a蛋白及其活性形式的表達變化。2.應用wb及激光共聚焦檢測hpmecs中ve-cadherin、f-actin的表達和定位。3.應用e-platel8培養(yǎng)板培養(yǎng)hpmecs,通過icelligence系統(tǒng)實時監(jiān)測內(nèi)皮細胞屏障功能。4.hpmecs轉染ncsirna、rab5asirna、ncplasmid、rab5awtplasmid后,抑制或過表達rab5a的表達,并應用wb及激光共聚焦技術檢測ve-cadherin、f-actin的表達及定位變化;應用激光共聚焦檢測細胞頂端標記物足萼蛋白(podocalyxin,podxl)的頂端-基底側極性表達情況。5.應用transwell小室培養(yǎng)hpmecs,并檢測fitc-dextran的透過率以反映內(nèi)皮細胞通透性。6.應用cy3-標記的rab5asirna體內(nèi)轉染c57bl/6小鼠,6天后收集小鼠肺臟、肝臟、脾臟及腎臟組織標本置于液氮中保存,用于冰凍切片免疫熒光檢測cy3在組織器官的分布情況,rt-pcr檢測各組織器官中rab5amrna的表達情況,以計算rab5asirna的轉染抑制率。7.膿毒癥模型的建立。20mg/kglps腹腔注射入轉染或未轉染rab5asirna的c57bl/6小鼠體內(nèi),24h后收集肺組織,冰凍切片用于免疫熒光檢測肺組織中rab5a的表達情況;石蠟切片,用于he染色進行組織病理學檢測。8.肺血管通透性檢測,40mg/kg伊文思藍在lps處理結束前2h尾靜脈注入c57bl/6小鼠體內(nèi)檢測肺組織中伊文思藍的含量以反映肺血管通透性。9.觀察體內(nèi)抑制rab5a表達后膿毒癥小鼠生存率變化。轉染或未轉染rab5asirna的c57bl/6小鼠腹腔注射40mg/kglps,后每天四次固定時間觀察小鼠生命體征,共觀察5d。1.LPS處理HPMECs后Rab5a的表達及Rab5a GTP酶的活性均增加。LPS引起了骨架蛋白聚合,誘導細胞皮質部位大量應力纖維形成。2.LPS減少了HPMECs胞膜VE-cadherin的表達,增加了其在胞漿中的表達,總量未變。LPS引起VE-cadherin轉位。通過與內(nèi)涵體標記物EEA1、Rab5共標顯示,LPS引起了HPMECs中VE-cadherin的內(nèi)吞。LPS還引起骨架蛋白F-actin的重構,并且破壞了內(nèi)皮細胞極性及其屏障功能。3.Rab5a調控LPS損傷引起的VE-cadherin的內(nèi)吞。應用Rab5a si RNA抑制Rab5a表達后,LPS引起的VE-cadherin內(nèi)吞明顯受到抑制,抑制了LPS引起的胞膜VE-cadherin的減少。然而應用Rab5a WT質粒過表達Rab5a對LPS引起的VE-cadherin內(nèi)吞無明顯影響。4.Rab5a可以調節(jié)F-actin的排列、Podxl頂端-基底側的表達,從而影響內(nèi)皮細胞頂端-基底側細胞極性。抑制HPMECs中Rab5a的表達后明顯減弱了LPS引起的骨架重構及Podxl異常的頂端-基底側表達,有助于維持內(nèi)皮細胞極性。5.Rab5a調節(jié)HPMECs的屏障功能。應用細胞屏障功能及內(nèi)皮通透性檢測,結果顯示Rab5a si RNA明顯抑制了LPS引起的屏障破壞并降低內(nèi)皮通透性的增加。6.體內(nèi)實驗證實膿毒癥小鼠肺組織中Rab5a的表達明顯上調。7.體內(nèi)實驗研究顯示Rab5a siRNA可成功轉染至小鼠體內(nèi),Rab5a siRNA明顯抑制了小鼠肺組織中Rab5a的表達。抑制Rab5a表達的可明顯減弱LPS引起的肺損傷程度及肺血管的通透性,并且提高了膿毒癥小鼠的生存期。結論:1.體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)LPS可上調肺內(nèi)皮中Rab5a的表達及Rab5a GTP酶的活性。2.Rab5a可調節(jié)HPMECs中VE-cadherin的胞吞和F-actin的分布;并可調節(jié)HPMECs頂端-基底側細胞極性及內(nèi)皮屏障功能。3.抑制Rab5a的表達可部分防治LPS引起的肺損傷。
【關鍵詞】：Rab5 GTP酶 VE-cadherin 肌動蛋白細胞骨架 細胞極性 內(nèi)皮屏障功能 急性肺損傷
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R563
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 LPS對肺微血管內(nèi)皮細胞屏障功能的破壞16-41
• 2.1 LPS對肺微血管內(nèi)皮細胞Rab5 GTPase表達的影響16-28
• 2.1.1 材料和方法16-25
• 2.1.2 結果25-27
• 2.1.3 討論27-28
• 2.1.4 小結28
• 2.2 LPS對肺微血管內(nèi)皮細胞屏障功能的影響28-41
• 2.2.1 材料和方法28-34
• 2.2.2 結果34-40
• 2.2.3 討論40
• 2.2.4 小結40-41
• 第三章 Rab5 GTPase調節(jié)肺微血管內(nèi)皮細胞屏障功能41-61
• 3.1 Rab5 GTPase調節(jié)HPMECs粘附連接VE-cadherin的胞吞作用41-52
• 3.1.1 材料和方法41-47
• 3.1.2 結果47-51
• 3.1.3 討論51-52
• 3.1.4 小結52
• 3.2 Rab5 GTPase調節(jié)肺微血管內(nèi)皮細胞極性及內(nèi)皮屏障功能52-61
• 3.2.1 材料和方法52-55
• 3.2.2 結果55-59
• 3.2.3 討論59-60
• 3.2.4 小結60-61
• 第四章 Rab5 si RNA體內(nèi)轉染可保護膿毒癥小鼠肺血管內(nèi)皮屏障功能61-85
• 4.1 LPS對膿毒癥小鼠體內(nèi)Rab5a表達的影響61-67
• 4.1.1 材料和方法61-65
• 4.1.2 結果65-66
• 4.1.3 討論66-67
• 4.1.4 小結67
• 4.2 Rab5 si RNA體內(nèi)轉染在小鼠體內(nèi)的分布情況67-77
• 4.2.1 材料和方法67-73
• 4.2.2 結果73-76
• 4.2.3 討論76-77
• 4.2.4 小結77
• 4.3 Rab5 si RNA體內(nèi)轉染對膿毒癥小鼠內(nèi)皮屏障功能的調節(jié)77-85
• 4.3.1 材料與方法77-80
• 4.3.2 結果80-83
• 4.3.3 討論83-84
• 4.3.4 小結84-85
• 全文結論85-86
• 參考文獻86-93
• 文獻綜述一 VE-cadherin相關研究進展93-109
• 參考文獻102-109
• 文獻綜述二 肌動蛋白微絲與內(nèi)皮屏障功能109-119
• 參考文獻113-119
• 在讀期間發(fā)表論文情況119-120
• 致謝120-121

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本文編號：256980