本文關(guān)鍵詞：Rab5 GTPase介導(dǎo)的VE-cadherin內(nèi)吞調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:血管內(nèi)皮細(xì)胞襯于血管壁內(nèi)側(cè)形成半選擇性的通透屏障,可以調(diào)節(jié)血漿蛋白、溶質(zhì)、液體及炎癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。內(nèi)皮完整性是維持內(nèi)皮屏障功能的基礎(chǔ)。內(nèi)皮屏障的破壞及內(nèi)皮通透性的增加是許多急慢性炎癥性疾病發(fā)病機(jī)制中必不可少的組成部分,其中包括急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤等。細(xì)胞間連接包括粘附連接、緊密連接、橋粒和縫隙連接。其中內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)粘附連接和緊密連接,它們?cè)诰S持內(nèi)皮細(xì)胞完整性及內(nèi)皮細(xì)胞正常生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞間粘附連接參與調(diào)控多種細(xì)胞功能,包括建立和維持細(xì)胞間粘附、細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等。緊密連接主要參與調(diào)控內(nèi)皮通透性。研究表明粘附連接的組裝和構(gòu)建先于緊密連接,并且作為內(nèi)皮特異性的粘附連接—血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)在維持血管完整性上起重要作用,包括骨架重排、細(xì)胞極性的建立及緊密連接的重構(gòu)等。研究表明Rab蛋白是一類小分子GTP結(jié)合蛋白,在囊泡運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)、粘附、錨定和融合等不同階段均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Rab蛋白通過介導(dǎo)囊泡運(yùn)輸,調(diào)節(jié)多種細(xì)胞表面受體分子的表達(dá)和功能。其中,Rab5作為早期內(nèi)涵體的標(biāo)記物,可介導(dǎo)胞膜蛋白至內(nèi)涵體的囊泡運(yùn)輸。既往研究表明Rab5不僅可以調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCR)的轉(zhuǎn)運(yùn),還參與調(diào)控細(xì)胞間連接蛋白的定位,并且Rab5可通過影響受體酪氨酸激酶的活性來調(diào)節(jié)邊緣細(xì)胞遷移和極性。另外,Rab5及其效應(yīng)因子在維持平面細(xì)胞極性(planar cell polarity,PCP)中也發(fā)揮重要作用。然而,作為粘附連接的重要組分—VE-cadherin,能否被Rab5調(diào)控及Rab5如何調(diào)控其內(nèi)吞,繼而調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞極性及屏障功能目前尚不明確。本研究中我們應(yīng)用人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human lung microvascular endothelial cells,HPMECs)通過抑制或過表達(dá)其中Rab5的表達(dá),觀察脂多糖(LPS)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中VE-cadherin內(nèi)吞、骨架重構(gòu)及細(xì)胞極性的影響,并且應(yīng)用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究Rab5對(duì)內(nèi)皮屏障功能的調(diào)節(jié)作用。初步探討了Rab5調(diào)節(jié)內(nèi)皮屏障功能的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有望為內(nèi)皮屏障功能障礙和血管炎癥的防治提供新的思路和有價(jià)值的潛在靶標(biāo)。研究目的:1.明確lps對(duì)hpmecs中rab5表達(dá)及活性的影響。2.探討rab5對(duì)hpmecs中ve-cadherin內(nèi)吞及細(xì)胞極性的調(diào)節(jié)作用。3.體內(nèi)外研究探討rab5調(diào)節(jié)內(nèi)皮屏障功能的機(jī)制。研究方法:1.培養(yǎng)hpmecs,應(yīng)用westernblot(wb)檢測(cè)lps處理后不同時(shí)間點(diǎn)hpmecs中rab5a蛋白及其活性形式的表達(dá)變化。2.應(yīng)用wb及激光共聚焦檢測(cè)hpmecs中ve-cadherin、f-actin的表達(dá)和定位。3.應(yīng)用e-platel8培養(yǎng)板培養(yǎng)hpmecs,通過icelligence系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能。4.hpmecs轉(zhuǎn)染ncsirna、rab5asirna、ncplasmid、rab5awtplasmid后,抑制或過表達(dá)rab5a的表達(dá),并應(yīng)用wb及激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)ve-cadherin、f-actin的表達(dá)及定位變化;應(yīng)用激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞頂端標(biāo)記物足萼蛋白(podocalyxin,podxl)的頂端-基底側(cè)極性表達(dá)情況。5.應(yīng)用transwell小室培養(yǎng)hpmecs,并檢測(cè)fitc-dextran的透過率以反映內(nèi)皮細(xì)胞通透性。6.應(yīng)用cy3-標(biāo)記的rab5asirna體內(nèi)轉(zhuǎn)染c57bl/6小鼠,6天后收集小鼠肺臟、肝臟、脾臟及腎臟組織標(biāo)本置于液氮中保存,用于冰凍切片免疫熒光檢測(cè)cy3在組織器官的分布情況,rt-pcr檢測(cè)各組織器官中rab5amrna的表達(dá)情況,以計(jì)算rab5asirna的轉(zhuǎn)染抑制率。7.膿毒癥模型的建立。20mg/kglps腹腔注射入轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染rab5asirna的c57bl/6小鼠體內(nèi),24h后收集肺組織,冰凍切片用于免疫熒光檢測(cè)肺組織中rab5a的表達(dá)情況;石蠟切片,用于he染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。8.肺血管通透性檢測(cè),40mg/kg伊文思藍(lán)在lps處理結(jié)束前2h尾靜脈注入c57bl/6小鼠體內(nèi)檢測(cè)肺組織中伊文思藍(lán)的含量以反映肺血管通透性。9.觀察體內(nèi)抑制rab5a表達(dá)后膿毒癥小鼠生存率變化。轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染rab5asirna的c57bl/6小鼠腹腔注射40mg/kglps,后每天四次固定時(shí)間觀察小鼠生命體征,共觀察5d。1.LPS處理HPMECs后Rab5a的表達(dá)及Rab5a GTP酶的活性均增加。LPS引起了骨架蛋白聚合,誘導(dǎo)細(xì)胞皮質(zhì)部位大量應(yīng)力纖維形成。2.LPS減少了HPMECs胞膜VE-cadherin的表達(dá),增加了其在胞漿中的表達(dá),總量未變。LPS引起VE-cadherin轉(zhuǎn)位。通過與內(nèi)涵體標(biāo)記物EEA1、Rab5共標(biāo)顯示,LPS引起了HPMECs中VE-cadherin的內(nèi)吞。LPS還引起骨架蛋白F-actin的重構(gòu),并且破壞了內(nèi)皮細(xì)胞極性及其屏障功能。3.Rab5a調(diào)控LPS損傷引起的VE-cadherin的內(nèi)吞。應(yīng)用Rab5a si RNA抑制Rab5a表達(dá)后,LPS引起的VE-cadherin內(nèi)吞明顯受到抑制,抑制了LPS引起的胞膜VE-cadherin的減少。然而應(yīng)用Rab5a WT質(zhì)粒過表達(dá)Rab5a對(duì)LPS引起的VE-cadherin內(nèi)吞無明顯影響。4.Rab5a可以調(diào)節(jié)F-actin的排列、Podxl頂端-基底側(cè)的表達(dá),從而影響內(nèi)皮細(xì)胞頂端-基底側(cè)細(xì)胞極性。抑制HPMECs中Rab5a的表達(dá)后明顯減弱了LPS引起的骨架重構(gòu)及Podxl異常的頂端-基底側(cè)表達(dá),有助于維持內(nèi)皮細(xì)胞極性。5.Rab5a調(diào)節(jié)HPMECs的屏障功能。應(yīng)用細(xì)胞屏障功能及內(nèi)皮通透性檢測(cè),結(jié)果顯示Rab5a si RNA明顯抑制了LPS引起的屏障破壞并降低內(nèi)皮通透性的增加。6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)膿毒癥小鼠肺組織中Rab5a的表達(dá)明顯上調(diào)。7.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究顯示Rab5a siRNA可成功轉(zhuǎn)染至小鼠體內(nèi),Rab5a siRNA明顯抑制了小鼠肺組織中Rab5a的表達(dá)。抑制Rab5a表達(dá)的可明顯減弱LPS引起的肺損傷程度及肺血管的通透性,并且提高了膿毒癥小鼠的生存期。結(jié)論:1.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS可上調(diào)肺內(nèi)皮中Rab5a的表達(dá)及Rab5a GTP酶的活性。2.Rab5a可調(diào)節(jié)HPMECs中VE-cadherin的胞吞和F-actin的分布;并可調(diào)節(jié)HPMECs頂端-基底側(cè)細(xì)胞極性及內(nèi)皮屏障功能。3.抑制Rab5a的表達(dá)可部分防治LPS引起的肺損傷。
【關(guān)鍵詞】：Rab5 GTP酶 VE-cadherin 肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架 細(xì)胞極性 內(nèi)皮屏障功能 急性肺損傷
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 LPS對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的破壞16-41
• 2.1 LPS對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Rab5 GTPase表達(dá)的影響16-28
• 2.1.1 材料和方法16-25
• 2.1.2 結(jié)果25-27
• 2.1.3 討論27-28
• 2.1.4 小結(jié)28
• 2.2 LPS對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的影響28-41
• 2.2.1 材料和方法28-34
• 2.2.2 結(jié)果34-40
• 2.2.3 討論40
• 2.2.4 小結(jié)40-41
• 第三章 Rab5 GTPase調(diào)節(jié)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能41-61
• 3.1 Rab5 GTPase調(diào)節(jié)HPMECs粘附連接VE-cadherin的胞吞作用41-52
• 3.1.1 材料和方法41-47
• 3.1.2 結(jié)果47-51
• 3.1.3 討論51-52
• 3.1.4 小結(jié)52
• 3.2 Rab5 GTPase調(diào)節(jié)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞極性及內(nèi)皮屏障功能52-61
• 3.2.1 材料和方法52-55
• 3.2.2 結(jié)果55-59
• 3.2.3 討論59-60
• 3.2.4 小結(jié)60-61
• 第四章 Rab5 si RNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染可保護(hù)膿毒癥小鼠肺血管內(nèi)皮屏障功能61-85
• 4.1 LPS對(duì)膿毒癥小鼠體內(nèi)Rab5a表達(dá)的影響61-67
• 4.1.1 材料和方法61-65
• 4.1.2 結(jié)果65-66
• 4.1.3 討論66-67
• 4.1.4 小結(jié)67
• 4.2 Rab5 si RNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染在小鼠體內(nèi)的分布情況67-77
• 4.2.1 材料和方法67-73
• 4.2.2 結(jié)果73-76
• 4.2.3 討論76-77
• 4.2.4 小結(jié)77
• 4.3 Rab5 si RNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)膿毒癥小鼠內(nèi)皮屏障功能的調(diào)節(jié)77-85
• 4.3.1 材料與方法77-80
• 4.3.2 結(jié)果80-83
• 4.3.3 討論83-84
• 4.3.4 小結(jié)84-85
• 全文結(jié)論85-86
• 參考文獻(xiàn)86-93
• 文獻(xiàn)綜述一 VE-cadherin相關(guān)研究進(jìn)展93-109
• 參考文獻(xiàn)102-109
• 文獻(xiàn)綜述二 肌動(dòng)蛋白微絲與內(nèi)皮屏障功能109-119
• 參考文獻(xiàn)113-119
• 在讀期間發(fā)表論文情況119-120
• 致謝120-121

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 夏紅強(qiáng);E-cadherin在腫瘤組織的檢測(cè)及意義[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2003年06期

2 ;Expression of TGF-β1,Snail,E-cadherin and N-cadherin in Gastric Cancer and Its Significance[J];Chinese Journal of Clinical Oncology;2007年06期

3 熊小蔚;崔明;;T-cadherin與腫瘤[J];醫(yī)學(xué)綜述;2010年08期

4 ;E－Cadherin在膀胱乳頭狀移行細(xì)胞癌的表達(dá)[J];國外醫(yī)學(xué)(生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè));1996年02期

5 張文軍,張志謙,林仲翔,王耐勤,胡穎;Correlation between expression of cadherin and gap junctional communication in human lung carcinoma cells[J];Science in China(Series C:Life Sciences);1998年04期

6 ;The expression of N-cadherin/catenins/actin complex in human lung normal and carcinoma cells[J];Chinese Science Bulletin;1998年09期

7 ;Quantitative analysis of E-cadherin expression and clinicopathologic evaluation in gastric cancer[J];Chinese Medical Journal;1998年01期

8 Ge-Liang Liu;Han-Jie Yang;Tian Liu;Yun-Zhao Lin;;Expression and significance of E-cadherin,N-cadherin,transforming growth factor-β1 and Twist in prostate cancer[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2014年01期

9 王曦,吳人亮,郝天玲,陳芳;Effects of Cigarette Smoke Extract on E-cadherin Expression in Cultured Airway Epithelial Cells[J];Journal of Tongji Medical University;2000年01期

10 陳曉峰,丁嘉安,高文,易祥華,王海峰,李化;E-cadherin表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性研究[J];中國肺癌雜志;2002年04期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 ;Core Fucosylation Regulates E-cadherin Binding Affinity in Human Lung Cancer Cells[A];2008年全國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要[C];2008年

2 ;Epigenetic regulation of E-cadherin in HBV associate human Hepatocellular carcinoma[A];江蘇省遺傳學(xué)會(huì)第八屆會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

3 王冰晶;張志謙;;癌細(xì)胞cadherin亞型轉(zhuǎn)變及其分子機(jī)制[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)2005年學(xué)術(shù)大會(huì)、青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

4 ;Suppressed survival and proliferation of ovarian cancer cells by repressed MEK-ERK activation via knocking-down of E-cadherin[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)第七屆全國中青年腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議——中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)“中華腫瘤 明日之星”大型評(píng)選活動(dòng)暨中青年委員全國遴選論文匯編[C];2011年

5 ;N-cadherin:a potential receptor of GDNF[A];Proceedings of the 8th Biennial Conference of the Chinese Society for Neuroscience[C];2009年

6 Zhiyang Xu;Dechang Li;Baohua Ji;;Quantification of the stiffness and strength of cadherin ectodomain binding with different ions[A];北京力學(xué)會(huì)第20屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2014年

7 賈文亮;張慶瑜;;關(guān)于E-cadherin在胃癌和肺癌中表達(dá)情況的研究[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第三十三屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2013年

8 烏新春;倪志超;段昕所;宋有鑫;;綠色熒光蛋白標(biāo)記的T-cadherin基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染黑素瘤細(xì)胞株的建立[A];第五屆全國中醫(yī)藥免疫學(xué)術(shù)研討會(huì)——暨環(huán)境·免疫與腫瘤防治綜合交叉會(huì)議論文匯編[C];2009年

9 ;Manipulation of N-cadherin level and function through different methods results in distinct functional changes in hippocampal neurons[A];Proceedings of the 7th Biennial Meeting and the 5th Congress of the Chinese Society for Neuroscience[C];2007年

10 張憲真;陳隨芹;耿秀東;;N-Cadherin與E-Cadherin在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究[A];中國腫瘤內(nèi)科進(jìn)展 中國腫瘤醫(yī)師教育（2014）[C];2014年

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1 楊俊俊;Rab5 GTPase介導(dǎo)的VE-cadherin內(nèi)吞調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的機(jī)制[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 黎景佳;E-cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系[D];中南大學(xué);2010年

3 吳揚(yáng);VE-cadherin重組腺病毒偶聯(lián)氧化型甘露聚糖抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2005年

4 胡軍;E-cadherin與卵巢癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及機(jī)制研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2007年

5 來明名;肌球蛋白X與N-cadherin相互作用調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元輻射遷移[D];東北師范大學(xué);2013年

6 任劍珍;結(jié)腸癌T-cadherin基因的表達(dá)及甲基化影響的探討[D];中南大學(xué);2011年

7 張自森;E-cadherin在胃癌中的表達(dá)與化療療效的關(guān)系及對(duì)胃癌細(xì)胞化療敏感性的影響[D];鄭州大學(xué);2013年

8 余瓊芳;Li-cadherin與結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)性實(shí)驗(yàn)研究[D];武漢大學(xué);2009年

9 王博;E-cadherin在急性噪聲損傷中的分子機(jī)制研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2014年

10 張瑩瑩;乙肝病毒HBx蛋白誘導(dǎo)E-cadherin表觀遺傳沉默促進(jìn)細(xì)胞遷移的機(jī)制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

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1 衷燦梅;12-脂氧合酶通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 高玉梅;探索N-cadherin在卵巢癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用及意義[D];石河子大學(xué);2015年

3 林路;E-cadherin,β-catenin,N-cadherin在漿液性卵巢癌中的表達(dá)及意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

4 辛明;Galectin-3通過EGFR介導(dǎo)調(diào)控腫瘤細(xì)胞E-cadherin表達(dá)的機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

5 孟梅;VE-cadherin對(duì)血管穩(wěn)態(tài)的作用及調(diào)控機(jī)制[D];蘇州大學(xué);2015年

6 陶韜;VE-cadherin在非小細(xì)胞肺癌血管生成中的體外實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

7 李娟;E-cadherin在Ⅱ-Ⅲ期乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義[D];中南大學(xué);2012年

8 賈文亮;胃腺癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2014年

9 姜麗紅;胃癌中E-cadherin表達(dá)的多樣性及其影響因素的探討[D];大連醫(yī)科大學(xué);2006年

10 張志強(qiáng);T-cadherin，β-catenin在原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中的作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年

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