本文關(guān)鍵詞：ANO1在自發(fā)性高血壓大鼠血管中的表達(dá)及作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：原發(fā)性高血壓(EH)是一種獨(dú)立的疾病,同時(shí)又是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中等心腦血管疾病的高危因素,因此,如何有效的防治EH的發(fā)生發(fā)展對(duì)于預(yù)防心腦血管疾病至關(guān)重要。然而,到目前為止,由于EH的發(fā)病機(jī)制還不清楚,限制了臨床上對(duì)EH疾病的防治。經(jīng)典的鈣激活氯通道(CaCC)廣泛存在于心血管系統(tǒng)中,參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞興奮性及血管平滑肌的舒縮功能。然而由于其編碼基因未知,限制了經(jīng)典CaCC在心血管系統(tǒng)中作用的進(jìn)一步研究,直到Anoctamin1(ANO1)——anoctamins家族中的一員,被證實(shí)為經(jīng)典的CaCC的編碼基因,才開(kāi)啟了經(jīng)典CaCC在心血管系統(tǒng)中的作用研究的新篇章。最新資料表明,ANO1編碼的CaCC參與了對(duì)機(jī)體動(dòng)脈血壓的調(diào)節(jié);然而,ANO1是否參與了EH的發(fā)病過(guò)程呢?目前未見(jiàn)報(bào)道。因此,我們以自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)為EH的動(dòng)物模型,針對(duì)ANO1在EH發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮的作用進(jìn)行如下探討:(1)鑒定ANO1在SHRs不同部位血管中的功能性表達(dá)的情況;(2)觀察ANO1對(duì)SHRs血壓的影響及可能的機(jī)制。研究?jī)?nèi)容及所用的實(shí)驗(yàn)方法:1.利用Western blotting方法觀察ANO1在SHRs不同部位血管組織中的表達(dá);急性分離血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs),利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),記錄VSMCs ANO1依賴性的鈣激活氯電流。2.利用Western blotting方法檢測(cè)ANO1是否存在糖基化修飾。3.組織貼塊法原代培養(yǎng)大鼠VSMCs,觀察ANO1的表達(dá)及功能。4.利用血管灌流方法,針對(duì)大鼠腸系膜動(dòng)脈環(huán)進(jìn)行研究,利用ANO1的特異性抑制劑T16Ainh-A01探討ANO1對(duì)血管舒縮功能的影響。5.利用siRNA-ANO1干擾技術(shù)減弱SHRs內(nèi)源性ANO1的功能性表達(dá),進(jìn)一步觀察ANO1對(duì)SHRs收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)的影響。6.利用MTT法,觀察ANO1在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的VSMCs增殖中的作用;并利用原代培養(yǎng)的VSMCs,借助基因干擾技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證ANO1對(duì)VSMCs胞內(nèi)鈣信號(hào)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.與wistar-kyoto(wky)大鼠相比,在shrs頸動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈及其分支、股動(dòng)脈及其分支組織中,ano1的蛋白(150kd±)表達(dá)均顯著增多(p0.01);在原代培養(yǎng)的wky大鼠及shrs主動(dòng)脈及腸系膜動(dòng)脈smcs上ano1的蛋白表達(dá)水平亦表現(xiàn)出相似的結(jié)果;2.與來(lái)源于wky大鼠主動(dòng)脈及腸系膜動(dòng)脈的smcs相比,在來(lái)源于shrs胸主動(dòng)脈及腸系膜動(dòng)脈的smcs,可記錄到更加強(qiáng)的鈣激活氯電流,表明在血管組織中表達(dá)的ano1均為功能性cacc。利用sirna-ano1減弱原代培養(yǎng)的shrs腸系膜動(dòng)脈的smcs,所記錄到的鈣激活氯電流同未干擾的smcs相比顯著減弱;該結(jié)果表明,在vsmcs上所記錄的鈣激活氯電流是由ano1介導(dǎo)的。3.給予糖苷酶f處理從shrs及wky大鼠胸主動(dòng)脈中提取的蛋白后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ano1的蛋白分子量由處理前150kd±下降至130kd±的水平,表明在大鼠血管組織中的ano1蛋白存在著糖基化修飾。4.分別給予1,2,5,10,20,30μmol/l的ano1特異性抑制劑t16ainh-a01預(yù)孵育shrs及wky大鼠腸系膜動(dòng)脈環(huán)10min,然后給予1μmol/l的苯腎上腺素(pe)收縮血管。結(jié)果顯示,10μmol/lt16ainh-a01能夠顯著抑制pe誘導(dǎo)的wky大鼠腸系膜動(dòng)脈環(huán)的收縮,并且能夠引起1μmol/lpe預(yù)收縮的血管舒張;而20μmol/lt16ainh-a01則能夠明顯抑制pe誘導(dǎo)的shrs腸系膜動(dòng)脈環(huán)的收縮效應(yīng),表明可能是由于shrs腸系膜動(dòng)脈ano1蛋白表達(dá)高于wky,故需更大濃度的抑制劑才能表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)。在原代培養(yǎng)的wky腸系膜動(dòng)脈smcs,10μmol/lt16ainh-a01能夠減弱pe誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣熒光信號(hào)強(qiáng)度,說(shuō)明抑制ano1活性,可以通過(guò)降低vsmcs胞內(nèi)鈣來(lái)引起血管舒張。5.選取12周齡的shrs和wky大鼠,尾靜脈注射ano1特異性抑制劑t16ainh-a01,檢測(cè)40min內(nèi)大鼠sbp及dbp的變化。結(jié)果顯示,10μmol/lt16ainh-a01能顯著降低wky大鼠的sbp和dbp;而20μmol/lt16ainh-a01則能夠明顯降低shrssbp和dbp;鼠尾靜脈注射sirna-ano1-lipofectamin混合物,減弱shrs內(nèi)源性ano1的功能性表達(dá),觀察注射后5d以內(nèi)shrs血壓的變化情況。結(jié)果顯示,減弱內(nèi)源性ano1的功能性表達(dá),能夠顯著抑制shrs動(dòng)脈血壓(sbp和dbp)(p0.01)的升高。上述結(jié)果表明減弱內(nèi)源性ano1的功能性表達(dá)能夠降低shrs的sbp和dbp,延緩shrs高血壓的進(jìn)展。由此說(shuō)明,ano1可能參與了shrs高血壓的病理過(guò)程。6.在原代培養(yǎng)的wky大鼠腸系膜動(dòng)脈smcs,angⅡ能夠以濃度依賴性方式和時(shí)間依賴性的方式顯著促進(jìn)ano1的表達(dá)(p0.01);給予1型angⅡ受體(at1r)特異性抑制劑替米沙坦能夠顯著抑制angⅡ誘導(dǎo)的ano1的表達(dá),而at2r的特異性抑制劑PD123319則未表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng);表明AngⅡ可能是通過(guò)AT1R介導(dǎo)促進(jìn)VSMCs ANO1的表達(dá)。PI3K/Akt是AT1R的下游信號(hào)分子。結(jié)果顯示,SHRs腸系膜動(dòng)脈中Akt的磷酸化水平較WKY大鼠顯著升高;在原代培養(yǎng)的WKY腸系膜動(dòng)脈SMCs,AngⅡ能夠以時(shí)間依賴性的方式提高Akt的磷酸化水平;給予PI3K的特異性抑制劑LY294002能夠顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的來(lái)源于WKY大鼠的VSMCs ANO1的表達(dá)。這一結(jié)果表明AngⅡ誘導(dǎo)來(lái)源于WKY的大鼠VSMCs ANO1的表達(dá)可能是通過(guò)AT1R-PI3K-Akt通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。7.同WKY大鼠腸系膜動(dòng)脈相比較,SHRs腸系膜動(dòng)脈增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)顯著增多,與原代培養(yǎng)的腸系膜動(dòng)脈SMCs結(jié)果一致;MTT的結(jié)果顯示AngⅡ能夠促進(jìn)WKY大鼠源性VSMCs增殖;給予ANO1特異性抑制劑T16Ainh-A01能夠顯著抑制SHRs源性VSMCs及AngⅡ誘導(dǎo)的WKY大鼠源性VSMCs PCNA的表達(dá);同時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),利用siRNA-ANO1減弱SHRs VSMCs ANO1的表達(dá),能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞胞內(nèi)鈣的熒光信號(hào)強(qiáng)度。綜上所述,ANO1在SHRs血管中高表達(dá),可能促使了高血壓的發(fā)生發(fā)展,這一作用的發(fā)揮可能通過(guò)兩個(gè)方面機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn):一是促使VSMCs胞內(nèi)鈣的升高,加強(qiáng)SHRs血管收縮;另一方面,通過(guò)促進(jìn)VSMCs增殖,促進(jìn)SHRs血管重構(gòu)。本課題通過(guò)對(duì)ANO1在SHRs血管中的表達(dá)及作用的研究為進(jìn)一步探討EH的發(fā)病機(jī)制及有效的防治措施提供了新的靶向及新的作用靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：鈣激活氯通道 ANO1 自發(fā)性高血壓 血管重構(gòu) 血管緊張素Ⅱ
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R544.1
【目錄】：

• 摘要2-5
• Abstract5-12
• 引言12-14
• 第一章 材料和方法14-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑14-15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器15-16
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• 1.4 實(shí)驗(yàn)所需溶液16-17
• 1.5 實(shí)驗(yàn)方法17-25
• 1.5.1 Western blotting實(shí)驗(yàn)17-20
• 1.5.1.1 樣品蛋白的提取17
• 1.5.1.2 BCA法測(cè)定樣品蛋白的濃度17
• 1.5.1.3 電泳17-18
• 1.5.1.4 轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）18-19
• 1.5.1.5 封閉19
• 1.5.1.6 一抗孵育19
• 1.5.1.7 二抗孵育19
• 1.5.1.8 ECL免疫檢測(cè)19-20
• 1.5.1.9 分析20
• 1.5.2 血管灌流實(shí)驗(yàn)20-21
• 1.5.2.1 去內(nèi)皮腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)的制備20-21
• 1.5.2.2 血管灌流實(shí)驗(yàn)步驟21
• 1.5.3 組織貼塊法培養(yǎng)原代VSMCs21-22
• 1.5.4 膜片鉗技術(shù)記錄VSMCs ANO1誘導(dǎo)的鈣激活氯電流22
• 1.5.4.1 急性分離大鼠VSMCs22
• 1.5.4.2 電壓鉗記錄VSMCs鈣激活氯電流22
• 1.5.5 MTT法檢測(cè)VSMCs增殖活性22-23
• 1.5.6 siRNA-ANO1干擾實(shí)驗(yàn)23
• 1.5.7 利用Fluo-3AM檢測(cè)VSMCs胞內(nèi)鈣23-24
• 1.5.7.1 利用Fluo-3AM檢測(cè)細(xì)胞胞內(nèi)鈣的工作原理23
• 1.5.7.2 VSMCs胞內(nèi)鈣檢測(cè)步驟23-24
• 1.5.8 大鼠血壓的測(cè)定24-25
• 1.5.8.1 尾靜脈注射ANO1抑制劑T16Ainh-A01或者siRNA-ANO124
• 1.5.8.2 尾靜脈注射ANO1抑制劑T16Ainh-A01實(shí)驗(yàn)分組24
• 1.5.8.3 尾靜脈注射siRNA-ANO1分組24
• 1.5.8.4 測(cè)量SHRs及WKY大鼠動(dòng)脈血壓24-25
• 1.6 結(jié)果分析25-26
• 第二章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-48
• 2.1 ANO1在SHRs和WKY大鼠不同部位血管中的功能表達(dá)26-31
• 2.1.1 ANO1在SHRs和WKY大鼠不同部位血管組織及VSMCs中的蛋白表達(dá)26-27
• 2.1.2 在SHRs和WKY大鼠源性的VSMCs上記錄到經(jīng)典的鈣激活氯電流27-30
• 2.1.3 在SHRs和WKY大鼠血管上表達(dá)的ANO1存在糖基化修飾30-31
• 2.2 ANO1對(duì)SHRs及WKY大鼠去內(nèi)皮腸系膜動(dòng)脈環(huán)舒縮功能的影響31-34
• 2.2.1 腸系膜動(dòng)脈環(huán)的活性及內(nèi)皮去除的檢測(cè)31-32
• 2.2.2 ANO1對(duì)PE誘導(dǎo)的去內(nèi)皮腸系膜動(dòng)脈環(huán)收縮及舒張功能的影響32-34
• 2.3 ANO1對(duì)SHRs和WKY大鼠動(dòng)脈血壓的影響34-40
• 2.3.1 抑制ANO1活性對(duì)SHRs和WKY大鼠SBP及DBP的影響34-36
• 2.3.2 抑制ANO1活性對(duì)SHRs和WKY大鼠心率的影響36-38
• 2.3.3 減弱內(nèi)源性ANO1的表達(dá)對(duì)SHRs動(dòng)脈血壓的影響38-39
• 2.3.4 抑制ANO1活性降低PE誘導(dǎo)的VSMCs胞內(nèi)鈣的水平39-40
• 2.4 ANO1在VSMCs增殖中的作用40-44
• 2.4.1 AngⅡ通過(guò)AT1R-PI3K/Akt途徑上調(diào)VSMCs中ANO1的蛋白表達(dá)40-43
• 2.4.2 ANO1促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs胞內(nèi)鈣的升高43-44
• 2.5 ANO1在SHRs血管中高表達(dá)參與了VSMCs的增殖44-48
• 第三章 討論48-54
• 3.1 ANO1的高表達(dá)參與高血壓的進(jìn)程48-49
• 3.2 ANO1以不同的作用機(jī)制參與高血壓進(jìn)程49-52
• 3.2.1 ANO1可能通過(guò)Ca2+信號(hào)通路參與對(duì)血壓的調(diào)節(jié)49-51
• 3.2.2 ANO1可能通過(guò)促進(jìn)VSMCs增殖參與EH的進(jìn)程51-52
• 3.3 ANO1與AngⅡ之間相互作用共同參與高血壓的發(fā)展52-53
• 3.4 下一步工作計(jì)劃53-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 綜述63-80
• 綜述的參考文獻(xiàn)74-80
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果80-81
• 縮略詞表81-82
• 致謝82-83

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